菌落原位杂交（colony in situ hybridization）

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菌落原位杂交（colony in situ hybridization）

来源：互联网作者：未知发布时间：2006-08-06

菌落原位杂交（colony in situ hybridization）。是将细菌从一主平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释放出DNA，将DNA烘干固定于膜上与32P标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号、并与主平板上的菌落对位。
实验步骤如下：
①将硝酸纤维素滤膜置于含抗生素的平皿琼脂培养基上，用无菌牙签挑取单菌落种于滤膜和主琼脂平板上，排列成方格栅，膜和板上菌落位置相同。
②培养细菌至产生1-2mm大小的菌落。
③在一块平皿中置4张滤纸，用10%SDS浸透，倒掉多余液体，将带有菌落的滤膜取下轻轻置于滤纸上，菌落面在上，注意防止滤膜底面存有气泡。
④5min后，将滤膜转至用变性溶液（0.5mol/L NaOH,1.5mol/LNaCl）浸湿的滤纸上，放置10min。
⑤将滤膜转至中和溶液（1.5mol/L NaCl, 0.5mol/L Tris-HCl
pH8.0)浸湿的滤纸上，放置10min，重复中和一次。
⑥将滤膜移至用2×SSPE溶液浸过的滤纸上，放置10min，SSPE配成20×贮备液：3.6mol/L NaCl,0.2mol/L
NaH2PO4(pH7.4)，20mmol/L EDTANa2（pH7.4)。
⑦将滤膜用滤纸吸干，80℃真空烘干2h。

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