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四、生物芯片举例——Affymetrix
1、Affymetrix芯片的合成
美国著名的Affymetrix公司率先开发的寡聚核苷酸原位光刻专利技术，是生产高密度寡核苷酸基因芯片的核心关键技术。采用的技术原理是在合成碱基单体的5＇羟基末端连上一个光敏保护基。首先使支持物羟基化，并用光敏保护基团将其保护起来。每次选取适当的蔽光膜(mask)使需要聚合的部位透光，其它部位不透光。这样，光通过蔽光膜照射到支持物上，受光部位的羟基脱保护而活化。因为合成所用的单体分子一端按传统固相合成方法活化，另一端受光敏保护基的保护，所以发生偶联的部位反应后仍旧带有光敏保护基团。因此，每次通过控制蔽光膜的图案(透光与不透光)决定哪些区域应被活化，以及所用单体的种类和反应次序就可以实现在待定位点合成大量预定序列寡聚体的目的。使用多种蔽光膜能以更少的合成步骤生产出高密度的阵列，在合成循环中探针数目呈指数增长。某一含N个核苷酸的寡聚核苷酸，通过4×N个化学步骤能合成出4N个可能结构。例如：一段8个碱基的寡核苷酸有65，536种排列的可能，通过32个化学步骤，8个小时就能合成65，536个探针。其基本原理如图所示。
该方法的主要优点是可以用很少的步骤合成极其大量的探针阵列。在上述例子中合成65536个探针的8聚体寡核苷酸序列仅需4×8=32步操作，8小时就可以完成。而如果用传统方法合成然后点样，那么工作量的巨大将是不可思议的。同时，用该方法合成的探针阵列密度可高达到106/cm2。不过，该方法每步合成反应产率比较低，不到95%。因此探针的长度受到了限制。Affymetrix将光引导合成技术与半异体工业所用的光敏抗蚀技术相结合，以酸作为去保护剂，使每步产率增加到98%。原因是光敏抗蚀剂的解离对照度的依赖是非线性的，当照度达到特定的阈值以上保护剂就会解离。所以，该方法同时也解决了由于蔽光膜透光孔间距离缩小而引起的光衍射问题，有效地提高了聚合点阵的密度。另据报导，利用波长更短的物质波如电子射线去脱保护可使点阵密度达到1010/cm2。
2、Affymetrix的种类
Affymetrix的基因芯片有人、小鼠、大鼠和其他多种模式生物的表达芯片，方便研究人员定性和定量的研究相关生物的表达模式。芯片上的每一个基因或EST是由16-20对特异的25mer寡核苷酸探针组成，也就是说每个基因都是16-20段25个碱基的寡核苷酸特异序列组成，每一段序列对应一对25mer探针，其中一个是完全匹配(perfect match PM) 及中间有一错误位点匹配(mismatch MM)探针，因此，基因芯片上的每一个基因都是由芯片上的一个小方阵组成。该设计可提高探针的灵敏度和特异性，尤其针对在一个复杂背景的样品中低丰度表达产物的检测。这种PM-MM探针设计策略有助于区分特异性结合与非特异性结合的靶片段。
1） 人类基因组U95系列基因芯片
Human Genome U95 Set人类基因表达分析芯片U95系列：芯片上探针的种类涵盖来自UniGene 数据库(build 95，来源于GenBank 113和dbEST/10-02-99)中的60000种人类基因及EST片段，Genome U95A芯片上探针涵盖约12000种已知功能或者与疾病相关的全长人类基因，可用于研究在某种细胞类型或者组织中已知基因间的相互关系，比如研究某个信号通路中的关键基因以及前后效应分子的关系等等。Genome U95B、C、D和E芯片上探针涵盖总共约50000种EST片段。利用这组芯片可以研究和发现EST对应的未知/新基因的功能。Genome U95系列共计5种芯片涵盖超过60000个全长基因/和EST簇，不但包含第一代产品的全部信息，更加入新的信息，是研究人类基因表达模式的理想工具。
2）小鼠基因组U74系列基因芯片
Murine Genome U74 Set 小鼠基因基因组芯片U74系列：芯片上探针涵盖超过36000种全长小鼠基因及EST片段，来自UniGene(build 74)数据库，是最新开发、覆盖面最广的小鼠基因组芯片。Murine Genome U74 A上的探针涵盖全部约6000个已知功能的小鼠基因(Mouse UniGene database Build74)和另外约6000个EST簇。Murine Genome U74 B和C各有12000个EST。同样，这组芯片可以用于基因之间相互关系的研究，信号通路的研究和寻找新基因及功能。
3、Affymetrix芯片的流程。
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