14)你好：我有一个困惑了好长时间的问题，想请教。我的蛋白是2KD，在做非还原电泳时，发现除了目的蛋白外，有二聚体和多聚体存在。目的蛋白占44%，余下大部分为二聚体和多聚体。但在做反相HPLC时，只出现两个峰，第一主峰占90%（目的蛋白的位置），出峰时间为13分钟，第二主峰占10%，出峰时间为3分钟。请问在做HPLC时，二聚体和多聚体是否发生改变？用此方法测定含有二聚体和多聚体存在的目的蛋白纯度，是否不妥？我用柱子是C4柱，5υm,300埃。流动相B用0.05%三氟乙酸的乙腈，流动相A用0.05%三氟乙酸的纯水。
我觉得蛋白的聚合应该和存在的环境有很大的关系，但是即使如此，那聚合体在反相上能有这么大的差别吗，你可以用HPLC的凝胶过滤柱子在走一遍试试，或者你把第一个峰和后面的峰都跑电泳看是不是都是蛋白，如果第一个峰也是蛋白，那说明你推断是对的，如果不是，那就是没有分开。
我觉得测定聚合体还是用高效凝胶过滤色谱更好点，非还原电泳也应该不错，反相你可以查查文献有没有这么检测的。
目前检测protein aggregation的方法主要有四种。
1。gel filtration. 根据专门的mark，可以推断大致的聚合物的分子量，不过实际应用上看，影响的因素太多了，结果很不精确。
2。native gel. 大致上可能可以推断聚合的程度，不过结果实在不能让人信服。通常要与其他结果配合说明问题。
3。Dynamic light scattering：简单方便，结果可信，常用于挑选蛋白结晶的条件。但是对于浓度有限制。
4。超高速离心。
文献中多见1，3联用，3 explains the status of protein, and 2 explain the status of concentration-dependent aggregation.
有时也见过1，2联用的，不过仅用于说明次要问题。
15）请教阁下：我想把一种配基连接到环氧活化的琼脂糖上制备亲合介质，但是这种东西在一定比例的有机溶剂（如二氧六环）和水混合溶液中才溶解，似乎看过文献提到，有机溶剂会影响琼脂糖，不知如何处理这个问题？谢谢。
完全没有问题，因为有些琼脂糖凝胶活化时就在有机溶剂中，所以它们本身不会影响到活化后的琼脂糖的，相反在有机溶剂中环氧基团更不容易开环。所以你不用担心，你的配基稳定的话你可以用0.1MNaOH溶液混合你的有机溶剂室温偶联24小时就可以。
16） 最近我在用sephadexG-75的胶纯化蛋白，总共膨胀了3次新胶（其中第一次是一个批号，后两次是同一个批号），第一次是90度9个小时，加BSA4度过夜，第二次是按照安玛西亚上的时间90度3小时，还放在120度高压锅内灭菌，没有加BSA，第三次同第一次做法，结果发现，第一次的胶一开始的流速很快，根据说明书上给的线性流速可以达到37cm/h，而且分辨率很高，但后来两次，线性流速最快的时候也只有17cm/h，分辨率低得多，不知道是什么原因？？？？（我们用的玻璃管都是一样的型号）
这都很正常的处理应没有问题,但是还放在120度高压锅内灭菌不知道行不行,此外你用什么液体处理的填料呢,pH是在中性吗,在酸性和碱性条件下有可能会使结构破坏的,你可以测定一下.如果pH没有问题,那应该说填料本身没有问题.至于流速你的样品会不会比较粘,你柱压高不高, 如果柱压高,那填料变形压缩,那流速自然慢,而且分离效果不好,你的样品会不会有核酸或多糖,这样会影响的,因此你还是看看柱床体积有没有变化,如果缩小很明显,那你就重新装柱子.
17） 我们用c-18反向柱纯化蛋白，用的流动向是1%三氟乙酸，乙腈，不知道这两种东西，在什么浓度对蛋白有变性作用。
反相一般都是做分析的多,除非你的蛋白很稳定,否则不大适合做纯化,因此在有机溶剂中都有变性的可能,一般10%左右短时间应该没有问题,高了就很难说了,当然这也很蛋白本身关系很大,如果你真的想纯化,那建议还是改C3或C4这样温和点,你的有机溶剂也不需要很高的浓度就可以洗脱,也许会好点,你可以配合你的活性测定找到一个合适的浓度使你的蛋白活性回首率更好,纯化过程一定要快这样也降低变性的可能.
18）我有一单抗腹水，第一次纯化时，我先用50％硫酸铵沉淀，然后上HiTrap desalting脱盐，再过MonoQ强阴离子交换柱，用IFA检测抗体活性，合并收集峰，最后进行透析。第二次纯化时，是直接将腹水上脱盐柱，没有经过硫酸铵沉淀，结果两次纯化结果，第二次所的蛋白浓度是第一次的三倍多，纯化的抗体我主要是用来做胶体金标记，请问两种纯化过程，对抗体的纯度会有什么影响，是否会对标记效果产生差别？
腹水中应该有一些脂溶性物质以及一些别的杂质,沉淀后应该更干净点,直接过柱子要注意清洗,至于这两个方法具体效果如何,你可以跑电泳检测,同时也可以做抗体的活性检测,如果没有什么差别,那当然是回收率越高越好. 具体怎么样只有检测后才知道.
19） 用HPLC分析得到的结果对我们用普通的层析柱纯化有什么指导意义吗？
我觉得有意义如凝胶过滤的柱子,那可以知道分子量的分布以及别的信息,而如果是反相可以知道哪个蛋白的疏水性强,用离子交换的柱子可以知道电荷的不同,总之了解的信息越多对纯化越有用,所以说都是有意义的,只是很少有先做HPLC后做纯化的,大多先纯化后用HPLC分析.
20）离子交换层析，一般用氯化钠洗脱，可以用氯化钙洗脱吗？
没有问题,是盐都可以,只是小心钙离子容易和磷酸盐产生沉淀,你可以用别的缓冲液就没有问题.
21）我想请问高效凝胶过滤色谱柱那种比较好，用什么流动相，PH 多少为好？目的蛋白是2KD。
别客气，其实高效凝胶柱子一般用TSK系列的最多，你可以看看有没有分离范围窄点的柱子，只怕难有分离范围这么小的凝胶柱。流动相用缓冲液就可以。其实按你的分子量，用反相例如C3或者C4更合适，你也可以直接用C18的试试试，凝胶柱很贵，如果用不了那不是可惜了。
补充一下，由于分子量小，可以用MS来估计disulfide bond是否形成。形成一个，分子量减少2（失去两个proton）。
至于复性，建议在纯化之后进行。有文献证明，蛋白复性，成功的可能随纯度的提高而提高
因为HPLC用的填料一般是5-10um的,而通常用的填料至少也在35um以上,分离效果差别还是很大的,如果要把这么细的填料装在普通的柱子上,压力很大,一般的泵和系统,包括柱子根本承受不了那么大的压力,此外普通的层析系统的泵的精度管道等都很难保证有很高的分离效果,但是你可以把HPLC的条件直接用普通的填料来放大制备,例如你摸好了HPLC的反相或者亲和以及离子交换的填料,如果它们有相应的颗粒大的普通的填料,那就可以直接用HPLC上的条件,这样只要你HPLC的条件很好,那就可以,但是高效凝胶过滤色谱难在普通的柱子上放大,它也没有相应的填料.
22）你所提及的样品如含有核酸或多糖会影响sephadexG-75柱的流速及分辨率,具体何解？
我觉得是这样的：凝胶过滤的原理是小分子能进入的孔到多于大分子的，但是如果有多糖或核酸的干扰（很粘），这样一些小分子也不能进入更多的孔（和没有干扰的相比），这样自然分离效果不如没有干扰的。这是其一。
其二是由于这些东西粘度大，那么同样流速下，由于sephadexG-75压力比平常的大，所以胶会压缩变形，这样它的内孔和没有干扰的排阻极限也不同，所以分离效果自然比没有干扰要差。特别是压缩会使孔变得不均匀。
当然相对而言，前面的原因是最主要的，后面是次要的。
其实不仅是凝胶过滤，别的色谱有这两物质（还有一些脂溶性的物质）也会一样干扰传质，因此影响分离效果。所以这两个东西一般要小心，同时它还会降低柱子的寿命。
23） 我的目的蛋白是以可溶形式表达，MW=６KD,理论等电点为9.45．，无tag．我先用S-100除去了部分杂蛋白，但接着再用阳离子交换柱SP分离（２０mM PB ph=7.00），发现目的蛋白根本挂不上．我想试用硫酸铵分级沉淀除去部分杂蛋白，再过s-100.但不知硫酸铵分级沉淀该如何具体操作？
你可以先把缓冲液pH调到6试试能不能挂柱，此外其实你的蛋白分子量很小，杂质应该大多分子量比它大，你直接过sephadex G50那么大于30kd的很快就出来，或者上superdex 30 大于10KD的先出来，而你要的在后面，然后你再用离子交换试试，S-100分离范围比较宽，去杂质没有前面说的那两种好，此外你凝胶过滤后可能含盐那也挂不住，因为这样小的分子盐会和蛋白一起出来的，你测定样品的电导看看。
硫酸铵分级沉淀的方法其实很简单，一般就是用浓度从低到高的硫酸铵去沉淀蛋白，你可以直接在液体里加固体的硫酸铵就可以，到一定的浓度离心沉淀，上清继续加硫酸铵，再离心，上清再加硫酸铵，你可以设计你的实验，然后用电泳检测或者活性检测沉淀的效果。
24） 如果怀疑是多糖造成的黏度过大，请问应该如何去处多糖？
多糖去除你可以用硫酸铵分级沉淀,也可以用低温乙醇分级沉淀.一般的多糖也不带电荷,你可以用离子交换挂住你的蛋白,这样也是可以的
25） 问一个有关DEAE Sephadex A 50的问题，我的填料处理好后别人拿去用了，用了一次，结果我把他放到烧杯后，发觉已成絮状，不知有没有坏掉？可以再用吗？用什么方法可以把它恢复到原状？
这个絮状的东西有颜色吗，会不会是染菌了，或者是脏的东西没有处理干净，你可以用0.5MNaoH泡半小时，沉淀后倾去上清，做三次这样的处理，如果还有不干净的东西，你可以用6M盐酸胍泡半个小时，然后处理和NaoH一样，再换水，这样你看能不能洗回来，如果不能很好沉淀下来，那就不能用了。凝胶类的填料很容易长菌，用完得洗干净，保存在20%的乙醇中。
26） 我想在想纯化peg修饰的蛋白，可是我目前只有弱阳离子交换的羧甲基纤维素，你看能不能纯化阿，好像文献上都用sp-sepharose，纤维素是不是不行啊？另外，目前没有专门的层析装置和蠕动泵，我用普通的层析柱是不是就可以阿，流量是不是也不用太精确阿？谢谢！
离子交换的方法是可以的，但是我觉得疏水也很值得一做，因为修饰后电荷变化了，其实疏水性也增加了，所以这些方法都可以，此外只要你的CM纤维素能挂住就可以分离，，SP-sepharose只是更强点，而且流速更好点，你先试试，不行再换吧。没有蠕动泵纤维素流速会比较慢吧，流量肯定不精确，我觉得还是有个泵好点，没有检测器也不行，这些是纯化的基础，要不可是比较麻烦的，怕实验难重复。何况你没有泵也没有办法做线性剃度洗脱。反正是太简单点
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