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15) 1。我的蛋白bind在C4 column 上了，100％的ACN都没办法洗下来，异丙醇也试过了，还有什么好方法？
2。在跑RP-HPLC的时候，如果样品的盐浓度太高了，有影响么？
那实在不型可以考虑极性更低的乙酸乙酯等物质.此外洗不下来有没有可能变性沉淀在柱子上下不来,你的100％的ACN里面有三氟乙酸吗,我觉得出不来的原因有不少,不一定仅是洗脱的问题,所以用反相分离蛋白还是得很小心,此外不知道你的柱子是不是专门用于纯化蛋白的,因为孔径太小也不适合分离蛋白.
ACN 中含有1％的TFE。
有可能是蛋白变性，能用UREA or Guanidine hydrochloride 洗么？
不过在用isopropanol洗的时候，会有一些峰，但好像总是洗不干净
column 是专门用来纯化蛋白的，是C4。不知道孔径是多少，不过C4的应该都差不多把。
我觉得如果是沉淀也有可能,要不你就少上点样,或者降低上样的浓度,此外尽量洗脱要快点,用变性剂怕不是好的方法,因为浓度太高,很容易有变性剂析出,这样堵柱子或管道更麻烦,你可以开始就增加点ACN 的浓度,这样吸附力弱点,你也可以添加点极性小的溶剂,这样可以避免吸附力太强而洗脱困难.
我想柱子应该没有问题.方法也没有错.
16)想请教细胞外基质中的蛋白怎样抽提。
这个可真的没有做过,不过一般的做法都是匀浆,然后用缓冲液提取,不知道你的是什么来源的样品,此外如果脂肪含量高可以先用冷的丙酮脱脂肪后再提取,我想细胞外基质中的蛋白也应该是用这些方法吧.
17)请问聚乙二醇的检测波长是多少？
聚乙二醇是没有紫外吸收的,所以没有检测波长,即使有吸收,那也只在210nm附近有弱末端吸收,而很多物质在这个波长都会有吸收,所以检测它怕是不容易.
18)怎么有效的去除蛋白溶液中的triton?超滤加PB洗涤是否是一种有效的方法？
你用透析或超滤试试吧,还有个方法是用冷的丙酮沉淀蛋白,这样表面活性剂还是溶解的,这样也可以去除.
用冷的丙酮沉淀蛋白，那么丙酮容易去掉吗？如果试试superfine g-25脱盐的方法去掉triton，可行吗？
丙酮很好去,很容易挥发走了,你也可以用除盐柱子去除,但是如果它是和SDS一样能和蛋白结合,那用通常这些除盐,透析,超滤都没有办法去除,只能用沉淀的办法,而且是用酸性丙酮沉淀才能去除.
19)那么，mPEG-maleimide的检测波长是多少？
maleimide应该有紫外吸收的,你可以用紫外分光光度器去做全波长扫描,然后可以找到它的特征吸收峰,用这个波长做检测波长就可以,一般的HPLC带二极管列阵检测器也可以做全波长扫描,或者你选几个波长做HPLC也可以,只要没有干扰就可以了.
20)我现在想纯化一种蛋白，我的蛋白是14kD的碱性蛋白质，流程是这样的：原核细胞内蛋白表达，裂解细胞，SP-sepharose盐离子层析，HPLC Mono S过柱，去盐，HPLC C18过柱，最后得到纯化的蛋白。上面是一个成熟的protocol，我一直没有做过蛋白纯化，所以想向斑竹请教，HPLC上样量这么小，我有5ml的量，要多久才完成？
我觉得为什么要用两次强的阳离子交换柱子呢,直接过一步Source 15 S应该也可以,这样可以省去一步,而后再上HPLC,其实如果你的纯化如果做得好,不上HPLC也有可能,除非你们这个蛋白要求纯度很高,HPLC也有大的柱子,1X25CM的,一次上样可以0.5mL,十次也就完了,我觉得纯化还是尽可能不用HPLC的最好,否则成本高,而且不好放大.
21)你好,我的目的蛋白是GST融合蛋白，大小为42kD（包括GST)，大肠杆菌表达，我想请教一下其纯化方法。
那很简单,破碎菌体,加pBS缓冲液稀释,上GST琼脂糖凝胶,然后洗平,用10mM还原谷胱甘肽洗脱,收集洗脱峰就可以得到你的蛋白.如果你的蛋白是包涵体,那需要复性再纯化就可以了,我给你发一份我们的材料供你参考.
22)有没有比较好的国产疏水层析填料，当然是做蛋白的？
国产也有相应的填料的,你pM你的邮件给我,我给你发一份国产的目录,不知道你需要多少量呢.疏水其实和亲和一样,只要配基团密度一样,载量就差不多,还有就是刚性好就可以了,填料的合成也不是很神秘的,更不是不可逾越的.
23)我的课题涉及多次不同蛋白质的纯化，我现有国外的一个protocol可以参考，但国内实验室的条件有限，担心如果任意更改纯化方法，结果不理想时又不好分析原因。十分地苦恼，想听听您的建议，不胜感激！
我纯化的第一个蛋白质，是由稀释复性而得的三个亚基组成的复合物，这里纯化的目的主要是脱盐更换缓冲液和浓缩(为了下一步的酶催化过程)。我己经用冷冻抽干法将200ml的体系浓缩为10ml，下一步准备用透析脱盐及超滤浓缩，但对于超滤离心管的选择还无头绪（条件有限不可能添置大型超滤设备）,上网查也不得要领，如果您有相关资料，能不能发到我的邮箱？junewu@sohu.com. 关于浓缩的方法，冷冻抽干法、PEG、蔗糖、硫酸胺沉淀法各有何优劣？冷冻抽干法和硫酸胺沉淀法会不会破坏蛋白的活性？蔗糖会不会影响后续的超滤?
我纯化的第二个蛋白质，是经过酶催化的该复合物（110KD），这里纯化的目的主要是去除体系中未组成复合物的单个亚基（36KD、13KD、1KD）及36KD亚基的aggregate，国外的protocol推荐用凝胶层析，但我询问做过的人说分离的效果并不理想（原因不清），我是应该优化凝胶层析的步骤还是应该选用其它的层析方法？没有蠕动泵和收集器（只有层析柱和低温冰箱）能不能做凝胶层析?如果能做如何尽量提高其分离效果？选择层析柱和填料有哪些原则和注意事项?
Native-PAGE时，样品的盐离子浓度和样品内的其它蛋白质会不会影响电泳结果呈阴性？Native-PAGE和一般SDS-PAGE不同之处是否仅仅在于： 凝胶和电泳、上样缓冲液中不加SDS；样品中不加DTT或β-巯基乙醇，不经100℃煮沸处理；电泳时保持较低的温度(4℃)？
问题多多，实在是因为本人是初次涉及蛋白质纯化领域的门外汉，除了您推荐过的书，您还能不能推荐一些专门的网站、公司的操作手册（您如果有买了产品才能获得的，能否也EMAIL惠赠？）谢谢！！！
1.10ml的样品除盐浓缩用透析就可以,这样体积不会变大,同时透析除盐完加PEG8000粉末在透析袋外面就可以浓缩,很方便,超滤包括离心管都不便宜,而且样品不多怕损失多,所以我觉得还是用简单的方法好.
至于浓缩,有条件那用冷冻干燥,超滤都是不错的,硫酸铵沉淀不能当作浓缩的手段,因为它需要蛋白到一定的浓度,而且浓缩后的样品要除盐,回收率也不高,透析袋+PEG浓缩我觉得也是不错的方法,特别适合没有超滤和冷冻干燥的实验室,而且成本低,适合小量不适合大量,蔗糖浓缩我们用过,应该不好用.冷冻干燥和硫酸铵沉淀一般蛋白都不会失活的.蔗糖一般不影响超滤,只是粘度增加,这样超滤会慢的.
2.既然文献是用凝胶过滤,你也用完全没有问题,我觉得分离这些分子量差别比较大的,那凝胶过滤是不错的选择,只要选择好合适的填料,装好柱子就可以,层析的基本条件还是要的,包括泵,检测器,记录仪,要不很难知道收集也不方便操作.填料的选择主要看你的目标蛋白和杂质分子量的差别,例如你的110KD和那些36KD以下的,那你可以这样选择sephadex G 75,你的这些36KD以下都在它3000-80000之内,而你的110KD在外水体积直接就出来,后面的都是小分子的,当然也可以选择Superdex 75,它的分离范围在70000-3000,只是它们价格不同,后面的填料刚性更好流速快,前面的便宜,流速慢些,这些就看你的经费了.
3.电泳别的蛋白不应该影响,但是盐是有影响的,所以样品要除盐,可以用凝胶过滤,透析,超滤除盐.保持底温也许是为了保持蛋白的活性,做小量制备.
4.http://www.ls.huji.ac.il/~purification/Purification_Protocols.html
这个网站有不少相关的材料,相信很有帮助,此外我可以把我们全部的材料发给你,希望对你有所帮助.
24)如果分离50KD,36KD,13KD这三种蛋白质，最好选用那种凝胶层析用填料？如何确定需用的层析柱的直径和高度？
2.如果实在没有泵，上样时应注意些什么？没有检测器和记录仪，最短的收集间隔时间是多长？
选择sephadex G75或者superdex 75,柱子的大小一般都是按你的处理量算的,通常的柱子大多是1.6x60,2.6x60,或者有100cm的柱子,内径为1.6或者2.6的.也也有更粗的.一般都不会有问题.
2没有泵那我觉得凝胶过滤很难收集样品,除非你用自动分部收集器按一定的体积去收集,然后用紫外分光光度器去扫描测定浓度,这样再根据每管的蛋白浓度做个色谱图,按峰型把各管合并,上样注意要沿柱子的四周缓慢加,最好先把下面出口封闭,让液体不流动,上完样品后再打开下口,这样可以保证上样比较均匀,当胶平面没有液体的时候再用你的平衡液体按上样的方法加就可以,然后再打开下口,千万别让液体流干,也不能把胶平面冲坏.收集的时候可以按5m或者10ml一管,时间是根据你柱子的流速.
25)请问那里有关于免疫组化Ｓ－Ｐ法具体操作步骤的资料？
SP免疫组化法，全称链霉菌抗生素蛋白-过氧化酶连接法。你购买的哪家试剂盒都有很详细的方法,或者你上一些提供试剂盒的公司网站联系他们都可以得到详细的材料.
下面的文献你可以看看.
http://www.nhhn.gd.cn/ylkj/zl/z6.htm
26) 师兄你好，
我有一个问题想请教，在以前的贴子中没有看到。我要做抗体的真核表达，为分泌表达，表达出来的蛋白没有标签，因为希望尽可能保持抗体的结构，因此不能用那些针对组氨酸等标签的的柱子，我的抗体是个融合蛋白，大约是IgG的三分之二大小，是sCFv和CH3连接而成二硫键连接的双链，没有CH2区，我看proteinA和proteinG柱子都是要结合FC，那我的蛋白FC不完全的话还能用吗？要不我怎么办啊？还有，对于没有标签的抗体是不是无法和细胞培养使用的小牛血清中存在的抗体样物质分开呀？是不是必须要无血请培养。我简直不知道该怎么设计实验啦。谢谢。
你好，我看的书上说CH3是FC受体的结合区，而C H2是补体结合区，这说明蛋白A和蛋白G应该是和CH3结合的，你可以表达出来用蛋白A或G的试试，此外抗体有很好的疏水性，用疏水色谱也可以用于纯化抗体以及抗体的一些片段，包括单链抗体，至于血清中的抗体，它们和亲和柱子以及疏水等的微小差别通过改变洗脱条件得到纯化，当然你可以用无抗体的血清培养或无血清培养，我觉得你还是选表达出来再说了，而血清中的白蛋白很容易用染料亲和的方法就可以去除。
27) chromatography,您好！我现在用的Ni-NTA进行亲和纯化一个约45KD的蛋白，关于菌体的破碎，有人推荐用溶菌酶，有人说超声波，我用溶菌酶试过一次，但12000*20min离心后，上清中没有目的蛋白，你能不能将相关的材料也发给我一份
用超声破碎的比较多,如果你有设备的话这样破碎比较好,因为时间短,破碎效果也好,而溶菌酶不完全,而且不大好操作,我不怎么做上游,不很清楚,你可以再仔细问问别人有关破碎的问题,纯化的材料我给你发一份,希望对你有所帮助.
28) 如果裂解液中加了一些蛋白酶抑制剂，纯化时要不要考虑尽可能最后去掉这些蛋白酶抑制剂？
一般添加的都是小分子的物质,而且也不会和目标蛋白结合,纯化过程一般就去除了,所以不用特别考虑去除的问题.
29) 选择sephadex G75或者superdex 75,柱子的大小一般都是按你的处理量算的,通常的柱子大多是1.6x60,2.6x60,或者有100cm的柱子,内径为1.6或者2.6的.也也有更粗的.一般都不会有问题.
1,我们实验室没有sephadex G75(3000-80000)，最接近的就是sephadex G100(4000-160000)，而且都是80年代的产品，如何判断还能不能用？网上可以找到这两种填料的说明书吗?
2,您所说的处理量指的是样品的质量(mg)还是上样的体积(ml)?就我所知有两种计算方法。其一是根据质量算：蛋白质技术手册(汪家政)上说有一种工式：柱直径=(m/10cm)1/3其中m是蛋白的质量(mg),柱的长度=柱直径*30，但这个柱直径的计算公式我没看明白，用不上；其二是根据上样体积算：如果上样量是1ml，按1%的柱床体积则需要100ml树脂，直径1.5-1.6，长度50-60，但如果按2-3%的柱床体积则只需要30-50ml树脂，这样柱参数的变化又极大。您通常是怎样计算的?(具体到我所要分离的蛋白上样量是1ml,包含杂蛋白的总质量是4mg)
3．100ml树脂和50ml树脂对样本的稀释度是不是2:1?
1.G100刚性不好,容易因为压力,盐变化而体积改变,实在没有办法也只能用这个,但是你要保持恒定的流速,,盐或缓冲液的浓度,这样才能保证有很好的分离效果,说明书我想不好找，但是它和所有的sephadex处理是一样的。
2，处理量对于凝胶过滤一般是按体积算，通常上样量是柱床体积的5%左右应该，如果很接近，也可以降低到2%，你的1ml样，1.6x60cm的足够了。
3。一般稀释至少在2以上。
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