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20)我想请问一下您在装柱（尤其是分子筛柱子）是否是按照填料的说明正向装呢，还是反向装？
我两种方法都试过的，但是只有一次是正向装完后，检测效价为30，000。请问装柱过程中除了填料和水要脱气和填料要一次性的倒入外，还有没有其他要注意的。最好能给我一个Protocol。谢谢！
另外，还有一个问题，我有一个90kD的融合蛋白（连GST），用GST的亲和柱纯化后总是有50多kD和20左右的杂蛋白。我用Sephacryl－S100能去掉它们吗？或者您可以给我一个更好的建议
1，我不明白，当然是正向装了，反向怎么装呢，其实装柱子只要均匀就可以，我几乎没测定过柱效，也没有Protocol，因为一般装的都没有问题，只要注意你说的几个问题就可以。
2。至于纯化的杂带你用抗体做WB看是不是降解的物质呢，你可以优化你纯化的条件，在平衡液体中提高盐的浓度，这样可以降低非特异吸附，这样再做做看，此外你可以用5mM,10mM.20mM还原谷胱甘肽阶段洗脱看看有什么结果，我觉得你先优化完如果没有纯化好，再用凝胶过滤吧，你可以选择sephadex G75或者是Superdex G-75，这样你的目标蛋白在外水体积中出来，后面的杂质在内水体积中，这样效果会更好点，如果用前面的S100不会比后面的两个填料效果好的。
22)chromatography 大哥
我做的是碱性磷酸酶,大约32KD,我现在只做到硫酸氨盐析粗提,想进步纯化,你那有没有层析方面的资料,（比如材料的选择原则、洗脱液的选择、操作等方面）
这个蛋白硫酸铵沉淀后你可以直接用疏水,要不就透析,然后上阳离子交换的柱子,这样纯化不知道能到多少纯度,此外可以用亲和的办法,我看到的是把物质偶联到琼脂糖凝胶上做亲和,例如对氨基苯磷酸.洗脱用磷酸盐竞争洗脱就可以,这是比较好的方法.我给你发一份填料选择指南吧,也许会有的有点用处,此外把我见到亲和的文献发给你一篇
chromatography 大哥, 谢谢你拉, 资料我收到了, 我先看看还有问题在找你帮忙了,定向合成化学配基亲和层析纯化碱性磷酸酶, 新型染料配基对碱性磷酸酶的亲和纯化是什么格式的我这解压缩后打不开了
文件是zip格式的,有winzip这个软件就可以打开了,应该很常见的.
23)chromatography 辛苦
我想纯化碱性蛋白酶, 具体方法设计如下:
65%硫酸胺沉淀,透析袋.
但是我的蛋白酶蛋白含量不损失是严重,不知道还有什么好的方法浓缩.
下一步纯化方法DEAE50, G200两种填料
不知道注意什么?谢谢
别客气,我不太清楚你说的但是我的蛋白酶蛋白含量不损失是严重,是什么意思,是损失严重吗,按理透析不应该有太大损失的,你可以用缓冲液把透析袋里面洗几次,这样能降低你的损失.其实上离子交换,不需要浓缩,直接上就可以了.DEAE50好象没有写全,是.DEAE50和G200其中.DEAE50DEAE-sephadex A50吗,G200也是sephadex G-200吧,它们随盐浓度压力,PH值体积都有比较大的变化用的时候要小心,小心流速,有不也许会堵柱子.别的很笼统,还是看看相关的书吧,也就是离子交换和凝胶过滤的问题,很难在这里几句话说得清楚.我觉得你该用DEAE琼脂糖凝胶,这样体积不随环境变化,流速也快,分离效果好.你的酶分子量是多少,G200分离范围很宽,不知道为什么选择这个,如果非用这样的范围,那可以选择sephacryl S-200代替,同样是流速快,好操作.
此外这个酶是丝氨酸蛋白酶类的吗,有没有抑制剂,类似底物,辅酶等,这样你可以考虑用亲和的方法去做.
24)his融合蛋白纯化后含有咪唑，怎样去除？是不是要用透析？我纯化后的体积比较小，约有100微升，怎样做透析？谢谢！
这么点,那用1ml预装柱脱盐应该可以,也可以有超滤离心管做,不知道你要做什么用,如果咪唑不影响就不用去了不可以吗.
25)chromatography好！我对你和cccDNA讨论的问题很感兴趣。我的蛋白只有部分可溶，大部分表达后为包涵体，是否我用你们所说的助溶剂溶解我表达的蛋白，之后去超声就可以提高蛋白的溶解度呢？
抱歉,讨论的太多,不清楚你指的是哪个帖子,你直接用8M尿素或者6M盐酸胍溶解吧,可以的话不需要加别的物质,一般说来盐酸胍溶解包涵体比尿素的好,此外如果你蛋白真的不好溶解,那就可以加triton 100,脱氧胆酸钠等去溶解,判断溶解的好坏最简单就是看电泳,如果溶解后的样品沉淀的部分还有很多你的目的蛋白,那说明溶解不好,反之就说明很好,不溶解的部分就可以不管了.超声可以增加溶解，但是不能用太强的超声处理，一般用清洗用的超声就可以，别用破碎用的。否则也许会使蛋白断裂。
26)请教chromatography兄，刚开始分离粗蛋白时一般用什么介质比较好，有人推荐用离子交换，具体应选择什么样的填料？比如提真菌蛋白
我觉得疏水也可以，真菌蛋白也是很大的一类，不清楚具体什么特性，你得对目标蛋白很了解才好选择，如果是未知的只能试阴阳离子柱，也可以用疏水，同时至少要建立检测的方法，否则很难判断纯化的效果。
27)最近我发现PMSF在一定程度上可以抑制我的蛋白的降解。
所以我想通过提前收获菌体上清（尽量减少杂蛋白比例），然后加入PMSF过疏水层析来纯化，用的是10%的硫酸铵来上样，但是，发现我的蛋白吸附不到柱子上了！！！是因为加了PMSF的原因吗（用异丙醇溶解的）？
还有，上次做的疏水蛋白好像吸附特别牢固，您建议加入多大浓度的甘油来洗脱来着？
还有就是离子交换过程可不可以在缓冲液里面加入甘油？好像有人说甘油有稳定蛋白的作用。
异丙醇可以降低疏水性,所以挂不上主要是这个原因,其实溶解可以用乙醇,这样你上柱子的时候就得相应加大硫酸铵的浓度,吸附牢固,洗脱可乙醇,甘油太粘,压力大,加到5%就足够.
甘油是有稳定蛋白的作用,但是浓度太低不一定管用,你试试吧,直接用PMSF不就可以了
chromatography 兄是指在洗脱缓冲液里面添加5％的乙醇吗？
乙醇不能降低蛋白的疏水性吗？还是能够降低蛋白的疏水性，但是没有异丙醇那么厉害？
是的,是降低环境的疏水性,也就降低了蛋白和填料的相互作用.所以异丙醇也是这个道理
28)我在原核表达了一个融合6his的蛋白,融合蛋白约15kd,表达量很大,但是用Ni琼脂糖纯化的时候发现蛋白不挂柱子,几乎全部都在穿透液里,重复了几次都是这样.
具体流程我是按照分子克隆的方法,用融菌酶破菌,然后加Triton100,DNase,RNase,离心,上清过滤后上.
你的柱子有没有变颜色呢，你把你的样品透析一下再上样看看，你的样品要用平衡缓冲液稀释，保证上样的环境和柱子平衡后的一样，上样的浓度要稀一些，流速要慢一些，这样保证吸附更好一点，此外在你的样品中直接加10mM咪唑，这样上样可以避免一些量很大的杂蛋白于填料吸附而使目标蛋白挂不住，此外你多大的柱子，上多少样品，你最好能把你的操作写清楚一些，这样好分析原因。
29)请问一下，GST融合蛋白一般是在柱上就切掉还是纯化后再切掉？如果是纯化后再切，那么切下的GST片断要不要除去？如果用凝血酶切，凝血酶要不要除去？
有在柱子上切的，也有纯化后切的，切下的片段可以用原来的亲和填料去除，凝血酶也需要去除的，你可以看下面的一些材料吧：
我的柱子几乎没有变颜色,从开始一直到咪唑洗脱完,一直是蓝的.
我是按照分子克隆所写的,每100毫升菌离心后加4毫升平衡buffer,每次样品大概是20mL,请问这样是不是不够?我没有买柱子,只有填料,每次使用2毫升的Ni-琼脂糖,以一个10mL的注射器和滤纸代替的柱子,不知这样是否可行? 所以由于怀疑结合不够,所以也试过把填料平衡后直接加到样品中,4度孵育过夜,还是依旧....
别客气，你透析一下样品再上吧，我觉得你也可以把你的样品再用平衡缓冲液稀释一倍，这样再上一下看看，怀疑是你样品的问题用注射器加滤纸也可以，但是滤纸很容易破，而且掉纤维，反正这样做也没有关系，你再试试吧，此外你的填料最好是重新鏊合过镍的，一个一个因素排除吧。
我的填料是新买的已鏊合的琼脂糖，不过是国产的。
问有没有可能是蛋白结构导致his被包裹，从而无法亲和？呵呵，乱猜的。另外，请问，Ni柱上样后是应该变颜色吗？
上样不会变色的，变成棕色就不能用了，我觉得你还是看看你样品有没有问题。此外你说的那样情况也许有，但是很少见，如果可能的话，你把它换到另一端看看。
30)以前请教过你的一个问题想再请你帮忙：
我做的是原核表达GST-融合蛋白，分子量46.9KD，通过SDS-PAGE电泳发现目的条带已经表达出来了，可溶，正在做纯化，但是过柱纯化后有杂带，现在我按你的建议多洗了几个床体积，杂带少了，但还是有，我用的是Glutathione Sepharose 4B的柱子，pharmacia公司的，就是那种小的已经做好的一次性的小柱子，它不用我调整流速和作用时间，填料也不用我自己弄的。
请问：
1.这种柱子有什么缺点吗？
2.我要蛋白的目的是免疫兔子取抗体，多抗和单抗各需要的蛋白量约多少，纯度要很高吗？
3.如果纯化不理想，能否多次SDS-PAGE电泳后切胶直接免疫？
1.柱子没有什么缺点，硬找的话，那也只是上样量小点，流速慢些，我们也生产这样的柱子，很好用，节省不少时间。
2，蛋白的量估计有10mg就可够了，你可以问免疫版的看对不对。
3可以直接切胶，纯度在95%左右就可以了。
31)我是学分子生物的，最近我们要用噬菌体展示技术找一个膜蛋白分子交互作用蛋白，因为噬菌体展示技术最基本、最关键的一步就是要纯化蛋白，但是完整膜蛋白纯化好象比较困难，而且表达的蛋白质形成了包涵体，另外它有三个二硫键，纯化过程中破坏包涵体的同时，可能又很难保证蛋白的活性，不知你有没有好的方法或经验可以告知。谢谢
这个我就不清楚了,膜蛋白本身就不好溶解,需要用表面活性剂,如果是包涵体那需要复性,有三个二硫键,你可以参考有二硫键包涵体复性的方法去做.
32)我是搞活性多糖及糖蛋白研究的，分离纯化方面是新手，我打算订一些填料（分子筛和离子交换）用来制备多糖和糖蛋白，由于填料种类太多，不知我该如何选择？请楼主推荐几种常用的填料组合，谢谢！
糖蛋白的纯化其实可以充分利用它们的特点可以用疏水,亲和(凝集素,硼酸类)这些方法去纯化,离子交换和凝胶过滤填料的选择得按你的分子量和等电点,你没有太具体的差数很难说,因为的确品种比较多.
33)我想从蛋白粗提物中分离的40KD以下的蛋白质做进一步的实验，蛋白质的具体性质不知道，应该选用什么样的分离纯化方法呢。谢谢。
那你看有没有截留分子量在50KD以上的膜,超滤到你要的的蛋白,,这样进一步用离子交换或者凝胶过滤去纯化,如果你的蛋白有一些特殊性质也可以用亲和或者疏水.
34)请教chromatography兄，我用Amersham 的Hitrap chelating 1ml 小柱来纯化带His-tag的蛋白，自己感觉洗脱峰还是蛮漂亮的，但是洗脱物跑出来的电泳很模糊，请问是什么原因啊？
色谱图漂亮也不一定电泳图就漂亮,模糊是不是你的蛋白浓度太低,有没有盐呢,如果是这样的话,那电泳图不会好看的,你把样品透析浓缩,再跑电泳看看.
35)楼主请问一下在做疏水层析的一些问题.
1.疏水的blinding buffer中一般要加那些试剂.
2.离子对试剂常用的有那些,在做疏水层析时是否应加这些试剂.
3.一般根据怎样的规则来选这些试剂和疏水填料
还有离子排组色谱的填料有那些呀,他的分离的机制又是怎样呢?
1.疏水通常情况下不需要添加什么物质,就是高浓度的硫酸铵,氯化钠等盐,离子对是适合做反相用,蛋白纯化中不加这些物质.常用的我就知道三氟乙酸别我也不清楚.
2.疏水的填料我们选择一般就用苯基的,别的不怎么用,一般用苯基足够了,实在不行再换别的.
3好象没有离子排组色谱,应该是凝胶过滤色谱吧,分离原理很简单,那就是因为凝胶是多孔的,所以小分子能进入更小的孔,而大分子进不去,因此小分子流经的路径大于大分子的,选择的填料最常用的也就是葡聚糖凝胶,葡聚糖混合琼脂糖凝胶,还有烯丙基接枝葡聚糖凝胶,代表的产品有sephadex系列,superdex系列,sephacryl系列,具体的填料结构和规格可以参考<生物工程下游技术>
36)我纯化的蛋白等电点预测为8.04左右,我用ph6.5的１０mM磷酸钠，１mM ＥＤＴＡ的缓冲液，柱的填料为ＣＭ－钎维素，上样后我用缓冲液洗柱以去掉没有结合的蛋白，不幸的是目的蛋白也被洗了下来，接下来的梯度洗脱根本就无用．请帮我看看是哪儿除了问提！
把缓冲液pH调低点，到5左右，样品要的盐浓度和pH都不能高于你平衡缓冲液的浓度。
37)请问sephadex G-25和QAE-sephadex A-25使用,再生的方法.
我要分离分子量700左右的物质,使用那种填料啊(用于工业化生产)
都可以用0.5MNaOH洗3个柱床体积,再用50%乙醇洗,然后保存在20%的乙醇中.
700左右的物质是什么东西,也许只能用RP-HPLC了.
38) 我的蛋白，从包涵体中纯化，用SKL溶解复性后上Sephadex G－100柱没问题，用PEG20000浓缩后再上DEAE－Sephadex A－50后不论用多大的NaCl浓度都挂在顶上下不来。都是在10度以下过的柱子，温度和缓冲系统都不成问题，是什么原因呢？吐血ing～～～～
也许是没有复性好,总之我怀疑是沉淀在柱子上了,你用变性剂洗试试.或者是你蛋白不稳定,沉淀在柱子上,所以洗不下来.
我的蛋白的确很不稳定，但是在这样的温度和操作强度下应该不是沉淀变性。另外，我是用SKL溶解包涵体后透析除SKL复性，用非变性PAGE检验过的，如果再用变性剂洗涤的话前面的工作不是白做了吗？
我尝试把柱子顶上的粘着蛋白的珠子再用SKL处理，丙酮沉淀后SDS－PAGE发现目的蛋白就在里面，真郁闷呢……
所以这说明你蛋白溶解性不好,你复性后的缓冲液应该和你上离子交换的一样,这样才不会沉淀,此外你可以用离子交换的缓冲液去稀释你的样品再上样,避免因为缓冲液不同而沉淀,此外你的蛋白是不是疏水性比较强,加点甘油或乙醇看能不能增加溶解性,此外要注意pH,这些原因都会影响你蛋白的溶解性.
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