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1)我在纯化一个天然蛋白，纯化出来后没有抗原活性，请教原因。
流程是这样：提取－－－－conA柱－－－－－DEAE柱（梯度洗脱）
－－－－－总蛋白－－－未结合部分－－－一个蛋白
－与抗体－－反应－－－－反应－－－－－－－不反应
很是苦恼，最近才发现这个宝地，请不吝赐教。
会不会是你的目标蛋白在最后一个柱子上有沉淀没有洗下来,或者失活了呢,你可以结合你的电泳图看看是不是把所有的蛋白都洗下来了,此外你的纯化工艺很有意思,第一步柱子好象没有太大意义,而且成本高,不如直接上离子交换看看.
首先谢谢你的答复。第一步柱子是去掉大部分与conA结合的蛋白，然后在上的交换柱，文献上基本上都这样，而且电泳显示确实去掉了很多的蛋白。不过我将试试直接上离子柱的效果。
电泳图显示的是除了最后纯化的蛋白外，几乎没有什么蛋白出来。离子交换柱不就是这种性质吗？我一直这样认为，蛋白挂在柱上，经过洗脱液洗脱得到自己的蛋白，没用的蛋白就洗不下来。不知对不对。
conA应该是去除糖蛋白的,离子交换和别的色谱一样也是有穿透的,洗脱也有你的目标蛋白和别的杂质,没用的蛋白不一定都是洗不下来.现在关键是你的目标蛋白如果上离子交换也洗得下来,那没有活性会不会是你的蛋白失去活性,或者是你检测的方法有偏差,有没有可能是pH或者盐干扰抗原和抗体的结合呢.
2)在层析过程中，我只是少量蛋白纯化，并且基本上是在4度层析柜中进行的，没有脱气，结果装柱装了几次，还是有一些气泡（开始在室温中装的，装好后放到层析柜中），由于样品已经处理好，最后一次有一些气泡我也没办法，我只能上样，结果在再平衡过程中出现很多峰，花了几个小时，还是没平衡，时不时又出现一个峰，真的很郁闷，这时我再看柱中的气泡时，几乎气泡都消失了，原来气泡一般都在柱壁上，是不是气泡跑到柱中间填料里去了？出现这么多峰，其它的问题都不存在，是不是气泡的缘故？如果装柱过程中有气泡，层析过程中会出现哪些情况？谢谢！
造成这样的问题主要是因为由于你的液体和柱子中的液体有温差, 这样两种溶液混合的时候就容易产生气泡, 你最好把你的溶液脱气,同时保持管道以及你的溶液温度都差不多,也就是液体也放在层析柜中,这样会好些,你说的问题说明的确是有气泡，气泡不是进入填料中间，而是出去了，或者变更小了，一直出到检测池中，所以一直有小峰上去又很快下来，装柱子装好后再放到层析柜中也不会有气泡的，主要还是有温差造成的，如果柱子中有气泡有两种情况，一是气泡一直不断，有气泡也赶不走，二是可以把气泡赶走，但是越多越难赶，因此最好是没有气泡，否则柱子分离效果也不好。
你说的情况似乎跟我的不一样，我装柱的时候，液体都放在层析柜里，并且恒流泵也放在层析柜中，柱中都是刚从层析柜中拿出来的,还有，我的很多峰并不像你说的那样上去又很快下来，慢慢上去，下得也很慢，持续的时间相当长，不知为什么？很急，做得很烦，是不是填料有问题？
气泡出的快慢和流速有很大的关系,流速慢,气泡比较大,所以上得慢,下来也慢,无论如何我觉得都是气泡的事,尽量要避免有温差.柱子中装的时候一定要没有气泡,否则很难赶走.
3)我这几天作DEAE sephadex 50离子交换，上样前检测有蛋白，但是洗脱梯度0.1mol/L到1mol/L。但是检测没有任何蛋白（280nm），实用的缓冲液tirs－Hcl 8.0
样品是碱性蛋白酶。不知道什么原因？谢谢！！
那你用更高的盐,如2M做个梯度你看看怎么样.也许你的蛋白要更高浓度的盐才能洗下来.
4)我有一个问题：我们的蛋白原来是用CM填料纯化的，洗脱条件都已经摸索好，最近我觉得我们CM填料有问题，我们还有SP填料，我想请问一下，如果我用SP填料的话，用CM填料的洗脱条件是否适用？能否得到相同的结果？
还有一个小问题：
使用分子筛时，每一种填料都有一个分级范围，我想请问一下，洗脱体积跟洗下来的蛋白的分子量之间的具体关系是怎样的？就是说，比如Sephadex G-25 的分级范围在1000～5000，多少柱床体积，分子量1000的蛋白分子就出来了？一般洗几个柱床体积就可以了？谢谢！
1.我觉得你换填料,那么条件一般是不会一样的,还得再摸一下条件,如果你是用线性梯度洗脱的方式,那直接重复看看就可以.反正都得做了才知道.
2,很难把握不同蛋白的洗脱体积,因为和你的蛋白特性,浓度,上样量流速等都有关系,做纯化还是得有检测器的,毕竟和除盐不一样.
5)我原核表达了一种Ｈis蛋白，买了博采公司的非变性条件下提取His Tag蛋白质的Ni＋填料，按照它的说明书在层析是用的Buffer含有Tris,Nacl,甘油和不同浓度的咪唑，洗脱液就含有甘油。我对洗脱液进行了冷冻干燥，可是甘油除不了，不知该怎么办？请指点！
直接透析就可以，你把你的邮件pM给我，我可以把我们的材料发给你做参考，其实不需要用甘油就可以，此外金属螯合最好别选择Tris缓冲液。我不知道博采公司是哪里的，好用吗，什么价格呢。
6)我最近纯化一个蛋白，发现CM填料装的柱用7～8个柱床的平衡缓冲液都无法平衡，并且用7～8个柱床的的氢氧化钠也也洗不出一条直线来，总是有峰出来，不知是怎么回事？请高手指点，希望能指出造成这种现象尽可能多的原因。谢谢！
是不是太脏了，多洗几个柱床体积，或者看有没有气泡，峰型是直上直下的吗，如果是这样那就是气泡。
这次绝对没有气泡，峰型也不是直上直下的，慢慢升起来后又慢慢降下去，也不知道是不是紫外检测仪不稳定？
也许是不稳定或者检测池脏了。你直接不过柱子走有没有这样的问题
7)我用amersham的Ni亲和柱变性条件下纯化E Coli表达的蛋白。菌体破碎后，用8M Urea溶解。样品10000g，10min，0.22v过滤，但进样过程中，柱子压力升高仍很快。很快就达到了压力上限，不得不停止进样。
我想降低一点尿素的浓度，使得压力降一些，但是提取时8M Urea比6M提取的更好。
考虑，样品中用8M Urea，Binding &elution buffer中使用4M Urea, 会不会有一些蛋白（或杂蛋白）由此在柱中沉淀呢？用1N NaOH CIP理论上应该可以把蛋白降解，柱子是否能通过CIP完全恢复原状呢？
另外，进样过程中压力升高，除了有蛋白，还有什么物质容易堵在柱子里呢？如何在进柱前除去呢？谢谢
另外，我用Superdex200 10/300预装柱分析Ni柱收集的目的蛋白（样品中含500mM IMI,8M Urea, 500mM NaCl,10% Glycerol,pH8.0），分子筛的buffer也用同样的buffer，可是，最后在19ml开始，出现好几个大峰，跑SDS-PAGE也没有蛋白band。不知道为什么我的buffer和样品buffer一样还会出现可能是溶剂峰？
Another question:
蛋白溶于有机溶剂中能保持其有活性的结构么？
30% ACN是不是能让蛋白复性呢？
1, 在纯化过程中上样的样品中pH和盐浓度,以及种类等组分一定要平衡缓冲液完全相同,至少相当,你的问题就在于平衡用的4M, 而样品用的是8M, 这样混合, 蛋白就会沉淀, 所以柱压高,没有办法纯化,解决这个问题的方法是AKTA可以倒洗,你用6M盐酸胍或者8M脲含有400mM咪唑反方向冲柱子,这样就可以使沉淀溶解, 同时咪唑可以把挂的蛋白洗下来,这样柱子就好了,用1N NaOH 变性蛋白也不能溶解, 根本没有用.你洗后再用水洗,再做CIP这样还可以好些.否则不用变性剂使蛋白溶解, CIP根本没用,还是堵柱子.此外还有注意的是你的样品很粘加上有甘油,黏度很大,所以相应压力也高,所以不用甘油也可以.
2,你的意思是说你的缓冲液中也有500mMIMI吗,我怀疑那几个峰不是蛋白,会不会是咪唑呢.此外也许有你的目标蛋白,但是浓度低,你得透析浓缩才能电泳看到,或者你用银染的方法看看.我怀疑你前面纯化也许没有你的目标蛋白,所以做这一步没有蛋白或者很少.
Another question:
蛋白溶于有机溶剂中能保持其有活性的结构么？
30% ACN是不是能让蛋白复性呢？
一般是不能,除非这个蛋白是亲脂性的,而且稳定性很好.
而我看的文献30% ACN只会使蛋白变性,不会复性的,除非你的蛋白是亲脂性,水中不溶解,而溶解在有机溶剂中,这就不是复性的问题,,是溶解性的问题.
1,我现在做的镍柱样品和buffer是一样的，都是8M Urea，降低尿素浓度只是一个想法，还没开始实施。
2，我的SEC中的peak1, peak2浓缩跑过电泳，都是我的目的蛋白。我的蛋白疏水性强，较容易聚集，所以才加的甘油。前面纯化应该纯化出来了。
3，SEC最后的peak4, 5用银染做过，没有蛋白条带，浓缩用BCA测过蛋白浓度基本没有。所以应该不是蛋白。这样就很怪了，我的SEC buffer中也有500mM Imidazole阿，基线走平了才进的样，为什么最后还会出峰呢？
4，乙腈的问题是由于有做蛋白结构的文献说我的目的蛋白在三氟乙醇或30% ACN中用CD测，三维结构是对的；也没有聚集体。当然，他们的蛋白是固相合成的。我在做蛋白复性，希望找到一个条件使得我的蛋白不聚集，且有三维结构，所以想试一下。
5，你说的CIP方法很有启发，多谢了。我用Urea,Gua-HCl,NaOH洗镍柱，柱的颜色都不如水洗时白，是不是变性剂和碱会使胶的状态发生变化呢？
1.抱歉，因为问题太多，所以没有看清楚。
2，即使是这样，那样品黏度大，而且有甘油，你得把流速降低，蛋白的浓度也不能高。
3。如果是有你的蛋白，那后面的也许是一些色素或别的有吸收的物质，不是蛋白也没有关系。
4。如果是这样，那你可以试试用这样的液体看能不能复性。
5，碱不能长时间洗镍柱子，那样镍也许会被还原的，何况单独在碱性条件下并不能溶解变性沉淀的蛋白。
8)我在最近不断的条件摸索下纯化到了我的目的蛋白，其中洗脱液是改用含0.1%SDS的系统，这样才能洗出蛋白（还原型谷胱苷肽就不行），但这样得到的蛋白还需要怎么样处理呢？
如果是这样，那我很长见识：），不知道你随后要做什么，所以很难知道要怎么处理。
其实还有一个问题随后出现，就是我之前用的是直接与sepharose 4B混合的纯化方法，就用0.1SDS洗脱可以，但是用预装柱就变成是是elution buffer（含还原型谷胱苷肽)才能洗脱，前者琼脂糖有一些过期而已，其他步骤基本一致，样品也是一样处理的，用SKL溶解包涵体，用TX100增加Binding，不知道为什么结果有差。
我之后的目的是功能检测，检测蛋白对癌细胞的促凋亡作用。
还有一点想问一下，上海生化所的低分子量Marker的每条蛋白带大约是多少蛋白量呀（20ul*20的），因为我不想做蛋白定量先，想先估计一下。
那也许你填料和样品混合时间较长, 所以吸附比较牢固, 因此用elution buffer洗不下来,而要用0.1SDS洗脱, 而过柱子相对吸附较弱, 所以elution buffer可以, 或者是你的这两种填料不一样造成的, 至于Marker我就不清楚了,你最好问卖东西的人,他们也许知道.
9)我一般洗镍柱都是用EDTA把镍脱去再洗，洗完再加镍，很麻烦。
用Gua-HCl,EtOH洗柱可以不脱镍么？
别客气。用Gua-HCl, EtOH洗柱可以不脱镍,放心吧
10)这里还要麻烦Chromatography兄一次，我作草鱼胰蛋白酶的提纯，用卵类粘蛋白合成SEPHAROSE-4B亲和柱提纯。
现在我碰到亲和柱洗脱液的问题。草鱼胰蛋白酶性质和哺乳动物的不同，哺乳动物的是碱性蛋白酶，而草鱼胰蛋白酶是酸性蛋白酶，在酸性区域不稳定，国外资料和我作的预实验都证明了这一点。经典的哺乳动物胰蛋白酶的提纯方法用pH2.5的酸性洗脱液洗脱，而这种方法对我的草鱼胰蛋白酶的提纯不适用。国外资料有苯甲脒琼脂糖凝胶提纯鱼胰蛋白酶的，用120mM苯甲脒在中性区域洗脱。我的卵类粘蛋白合成的SEPHAROSE-4B亲和柱能用120mM苯甲脒洗脱吗？
苯甲脒琼脂糖凝胶可以用苯甲脒洗脱，但是我不知道能不能用在你的柱子上，因为按道理蛋白和这两个填料的作用位点和方式也许不一样，因此我觉得不一定能用，除非它们作用方式是一样的，最实际的就是试试就知道。
此外我觉得既然文献用的是苯甲脒琼脂糖凝胶，那你也可以用这个填料，其实我们公司就有这个填料。此外你也可以换个配基例如胰蛋白酶抑制剂做配基，不过一般都是用降低pH的洗脱，所以实在没有办法你还是得用苯甲脒琼脂糖凝胶。
11)我用的介质是CM52（羧甲基纤维素的），柱子的直径是7CM，介质在上样过程中经常出现裂纹，请问这是为什么？这个问题怎么解决？
我怀疑是填料压得太紧,样品和平衡缓冲液是一样的吗,温度是一样的吗,我怀疑样品上柱子有气泡才会有裂纹,否则是不该有的.你要保证样品和平衡缓冲液温度一样,别直接从冰箱里拿出来就上样.
12)我想问一下DEAE FF柱缓冲液能不能用硼砂-硼酸缓冲液
阴离子柱一般都用TRIS-HCL，或者有用磷酸缓冲液但是前者对我的酶活有影响，后者PH值不够高，所以决定换BAFFER，不知道选择BAFFER的时候有什么依据
应该没有问题，其实缓冲液不过是调pH的，低浓度对离子交换影响没有象一些书上说的那样说不能用某个缓冲体系。所以我觉得大多都比较随意，常用的都是可以的。
13)真佩服搂主的豪言壮语，你果真能“制填料如煮小鲜，做纯化似拂轻尘“吗？我不太相信，国内好多前辈和专家都不敢这么夸口，我做了6年的蛋白纯化和填料合成工作，我觉得这个领域要做好，做精并不是一件轻松的事情.
“制填料如煮小鲜，做纯化似拂轻尘“是我对填料合成的理解,那就是填料合成和做汤差不多，就是熬，而纯化就象把杂蛋白象灰尘一样吹去才得到目标蛋白，我不觉得做填料和做纯化很容易。专家和前辈现在亲自做实验的不多，而做产业的更少，我也做了11年的纯化和填料，包括小分子的HPLC和生物大分子的中低压色谱，既然你是同行，有问题以后向你请教，精是要静下心来做的。我觉得做产品最难。
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