本法反应温和，对抗原、抗体免疫活性影响小，已被广泛应用。缺点是标记率较低，一般为20～40%。

　　1．原理此法是利用乳过氧化物酶（Lactoperoxidase）有促进微量过氧化氢对¹²⁵I^-的氧化作用，生成¹²⁵I⁺，并标记在多肽、蛋白质酪氨酸分子上。

　　2．方法以标记蛋白质抗原为例。

　　（1）反应液组成：蛋白质2～5μg溶于磷酸缓冲液10～25μl中，加入Na¹²⁵i 1m Ci(10μl)、乳过氧化物酶溶液25ng(10μl)、H₂O₂200ng(10μl)；

　　（2）在室温保温7min；

　　（3）加入H₂O₂200ng(10μl)；

　　（4）过7min再加入H₂O₂(3μl)；

　　（5）保温7min后，加入0.5ml、10mmol/L巯基乙醇以停止反应；

　　（6）10min后加入NaI载体溶液1ml ；

　　（7）按常规方法分离纯化。

　　3．注意事项

　　（1）LPO质量好坏，可直接影响标记率，LPO应在使用前新鲜配制，以防酶活性降低。

　　（2）LPO用量应小于总蛋白质用量的1%，以减少酶自身碘化而带入的放化杂质。

　　（3）碘化反应速率分析表明，酶的催化速度很快。

　　（4）碘化反应在pH4.0～8.5较宽范围内均可进行，最适pH值应依据蛋白质本身性质而定。

　　（5）H₂O₂应保持低浓度，如高于0.1mmol/L，对酶的活性将有抑制作用。

　　（三）Iodogen碘化法

　　此法具有标记率高、反应体积小（3ml水平）、可用低浓度的¹²⁵I原料、对多肽激素和蛋白质的免疫活性损失小、稳定等优点，系常规的碘化方法之一。

　　1．原理　用Iodogen为氧化剂，对蛋白质和多肽抗原进行碘化标记，把¹²⁵I直接引进分子中的酪氨酸残基上。标记过程中被标记样品不与Iodogen混合，标记后取出样品即停止反应，不使用任何还原剂。

　　2．方法

　　（1）标记之前，先把Iodogen溶于有机溶剂，涂于管底，并使之干燥。

　　（2）标记时，将蛋白质溶液10～20μg/10μl(0.5mol/L,pH7.5PB)置于反应管中，反应管置于冰浴中。碘化时，¹²⁵I与蛋白质克分子之比例为1～1.2。反应时间在温和的连续的搅拌下可达10min，从反应管中转移出反应混合液，使其反应停止。反应液转移到含有200μl0.01mol/L、pH7.2PB和0.15mol/L NaCl溶液中，层析分离前再放置5min，使其未标记的碘离子还原成分子碘，以避免在带有缓冲液的柱中使白蛋白碘化。

　　3．注意事项

　　（1）涂有Iodogen的反应管，有氮气中密封，并贮存在-20^℃条件下，至少可用3个月。打开管，使用时间很短。

　　（2）碘化反应时间，7min时标记率达最高，10min时略有减少。PH6.0～8.5时，标记率最高。

　　（3）Iodogen与蛋白质的比率是标记率的函数。最大的标记率是1克分子的Iodogen与8克分子或再多量之比。

　　（四）酰化试剂（Bolton和Hunter试剂）法

　　1．原理这个方法用酰化剂3--（4-羟苯基）丙酸—N琥珀酰胺酯（Bolton—Hunter试剂）做连接试剂，将¹²⁵I标记在羟苯基的2，5位置上，再将琥珀酰胺酯水解，通过一个酰氨键将3--（4—羟基—5—¹²⁵I—苯基）接在蛋白或多肽的末端氨基上。

　　2．方法¹²⁵I—Bolton—Hunter试剂可用氯胺T法自行制备，出已有该试剂的苯溶液作为商品出售。使用时取一定量的标记酯（μmol 蛋白用3～5μmol标记酯），用氮气吹除苯，投入欲标记蛋白5～10μg及缓冲液10～50μl,pH8.0～8.5为宜，在冰浴中反应15～30min后，加入多量氨基酸（如甘氨酸），使过量标记酯消耗掉以终止反应。

　　此法避免了蛋白质与氧化剂的接触，又避免了与放射性碘原子的直接接触，可防止碘源中有害物质对蛋白质的损伤，适用于标记缺乏酪氨酸的蛋白质或酪氨酸在活性中心，引入碘原子后会引起蛋白质的失活。其缺点是标记技术比较复杂，需要接触较多的放射性，经二步反应，碘标记率比较低。一般认为此法不宜标记短肽，而适于分子量大于1万的蛋白质。

　　（一）纯化标记化合物的常用方法

　　不论使用何种制备方法，要获得合格的标记化合物，都必须将反应物经过仔细的分离、纯化。另外，一些标记化合物，经过一定时间的存放后，往往会出现不纯物，而需再纯化。如碘标记生长激素（¹²⁵--HGH）,在刚标记的第2天，从Sephadex G-100过滤谱上可见，几乎所有的碘化HGH都集中在峰II；保存1个月后，峰II组份减少，峰I和峰III成分明显增加，峰I是集聚的标记生长激素，而峰III是不具有免疫活性的放射性化学杂质（图8--3）。

 
图8－3　¹²⁵I—HGH的Sephadex G-100过滤谱

实线：新鲜制备的 125—HGH　虚线：保存1个月的125I—HGHI

　　标记化合物的纯化方法，除制备比活度低而化学量又较多的标记物可用重结晶、蒸馏、萃取等常规方法外，一般需用微量分离技术，较方便的是层析法、离子交换法、凝胶过滤及高效液相层析法等。现以碘标记蛋白为例，说明以上各种方法的适用情况。

　　1．凝胶过滤法常用的是Sephadex G系列，也有Biogel—P系列。分离标记蛋白与无机碘时，通常用Sephadex G—25或G—50，然后用G—100进一步纯化。

　　2．离子交换法一般是制成离子交换层析柱，用于分离纯化短肽标记物。

　　3．透析法　能将标记蛋白与小分子化合物很好地分离。

　　4．电泳法可用来分离单碘化、多碘化及已受损伤的蛋白质。

　　5．亲和层析法利用蛋白质与其特异抗体或受体的结合来分离、纯化标记蛋白质。此法特异性强，保持生物活性好，但操作较复杂。

　　6．高效液相层析法此法最大优点是分离效果好、快速，但需特殊设备。

　　7．伴刀豆球蛋白A（ConA）吸附法ConA是一种植物凝集素，对糖蛋白有良好吸附能力，因此适于分离标记糖蛋白。吸附的标记糖蛋白可用含0.2mol/L甲基α-吡喃葡萄糖苷的PBS洗脱。

　　（二）标记化合物的主要质量指标

　　作为示踪剂及分析试剂的标记化合物，应具有比一般非标记化合物更高的质量要求。标记化合物的质量指标包括：放射性核纯度、放射化学纯度、放射性比活度、生物活性和免疫活性以及标记位置和定量分布情况等。

　　1．放射性核纯度及其检查方法

　　（1）放射性核纯芳可用下式表示：

　　放射性核纯度（%）=所需放射性核素的活度/样品的总放射性活度×100

　　（2）放射性核纯度的检查方法：每一种核素都有它的特征，即物理半衰期及射线能量，故可通过半衰期及射线能量的测定来鉴别所需放射性核的纯度。

　　①测定半衰期法：如短半衰期放射性核素，一般可采用时间跟踪法，每隔一定时间测量放射性一次，共测3～5个半衰期，以每次测得的放射性计数为纵座标，时间为横座标，在半对数纸上作图，并通过分析，可求出该放射性核素的纯度。

　　②测定射线能量法：利用每一放射性核素的特征射线谱来检查放射性核纯度。γ发射体可用γ能谱仪，如检测⁵⁷Co和⁵⁸Co的核纯度：纯β-发射体可用液闪仪，调节　道宽及淬火校正后，对如³H、¹⁴C、³²P的核纯度进行测量；而β、γ混杂垓素，则用吸收法测量，如^99mrTc中母体杂质^99mMo的含量测量，是通过适当厚度的铅屏蔽，将^99mTc 发射的能量为141ke V的γ射线减弱后，测定⁹⁹Mo发射的能量为739Kev 的γ射线。 共4页: 上一页 [1] [2] 3 [4] 下一页