| 模板质量 |
模板的质量会影响产量。DNA样品中发现有多种污染物会抑制PCR。一些在标准基因组DNA制备中使用的试剂，如SDS，在浓度低至0.01％时就会抑制扩增反应。分离基因组DNA较新的方法包括了DNAZol，一种胍去垢剂裂解液，以及FTA Gene Guard System，其可以同基质结合，在血液及其他生物样品中纯化贮存DNA（表8）。 |
表8. 基因组DNA分离方法
| Method |
Description |
| Proteinase K/phenol extraction |
Classic method |
| DNAzol® Reagents |
Fast, phenol-free DNA isolation |
|
模板浓度 |
起始模板的量对于获得高产量很重要。对大多数扩增满意，104到106个起始目的分子就足以在溴化乙锭染色胶上观察到。所需的最佳模板量取决于基因组的大小（表9）。举例说，100ng到1μg的人类基因组DNA，相当于3×104到3×105个分子，对于足以检测到单拷贝基因的PCR产物。质粒DNA比较小，因此加入到PCR中的DNA的量是pg级的。 |
表9. 基因组大小和分子数目的比例
| Genonic DNA |
Size(bp)* |
Target Molecules/µg of Genomic DNA |
Amount of DNA(µg) for -10^5 Molecules |
| E. coli |
4.7×10^6 |
1.8×10^8 |
0.001 |
| Saccharomyces cerevisiae |
2.0×10^7 |
4.5×10^7 |
0.01 |
| Arabidopsis thaliana |
7.0×10^7 |
1.3×10^7 |
0.01 |
| Drosophila melanogaster |
1.6×10^8 |
6.6×10^5 |
0.5 |
| Homo sapiens |
2.8×10^9 |
3.2×10^5 |
1.0 |
| Xenopus laevis |
2.9×10^9 |
3.1×10^5 |
1.0 |
| 1.0Mus musculus |
3.3×10^9 |
2.7×10^5 |
1.0 |
| Zea mays |
1.5×10^10 |
6.0×10^4 |
2.0 |
| pUC 18 plasmid DNA |
2.69×10^3 |
3.4×10^11 |
1×10^(-6) |
| *Haploid genome size |
|
酶的选择 |
除了使用高质量模板DNA，聚合酶的选择也会影响产量（见第十三章，PCR聚合酶的比较）。Platinum聚合酶比其他聚合酶产量高，因为它防止了PCR反应配制过程中的非特异性扩增（图24）。对长片段（最大到12kb）的高灵敏度PCR，应选择酶混合物，最好是Platinum形式，如Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity。这种酶结合了Platinum技术和酶混合物（Taq DNA聚合酶同带有校正功能的聚合酶混合物）的优点。 |
收藏
推荐
评论(0条)
