| 问 题 |
可能原因 |
建议解决方法 |
| RT-PCR灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物 |
RNA被降解 |
在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA
使用良好的无污染技术分离RNA
在将组织从动物体取出后立刻处理
在100％甲酰胺中储存RNA如果使用胎盘RNase抑制剂，不要加热超过45℃或pH超过8.0，否则抑制剂或释放所有结合的RNase。而且，在≥0.8mM DTT时加入RNase抑制剂，一定要存在DTT。 |
| RNA中包含逆转录抑制剂 |
通过乙醇沉淀RNA除去抑制剂。用70％（v/v）乙醇对RNA沉淀进行清洗。可以加入糖元（0.25μg到0.4μg/μl）以帮助小量样品RNA的恢复。
逆转录抑制剂包括：SDS，EDTA，甘油，焦磷酸钠，亚精胺，甲酰胺和胍盐。
将对照RNA同样品混合，同对照RNA反应比较产量以检验抑制剂。 |
| 多糖同RNA共沉淀 |
使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖。 |
| 用于合成cDNA第一链合成的引物没有很好退火 |
确定退火温度适合您的引物。对于随机六聚体，建议在反应温度保温之前先在25℃保温10分钟。
对于基因特异性引物（GSP），可以试一下其他GSP，或换用oligo(dT)或随机六聚体确定GSP是反义序列。 |
| 起始RNA量不够 |
增加RNA量。
对于＜50ng的RNA样品，可以在第一链cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg乙酰BSA。 |
| RNA模板二级结构太多 |
将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火
提高逆转录反应温度，对SuperScriptⅡ可以到50℃，对ThermoScript可以到65℃。
注意：不要在＞60℃时使用oligo(dT)引物，选择一个在反应温度可以退火的GSP。
对于＞1kb的RT-PCR产物，保持反应温度≤65℃。
注意：不要在高于37℃时使用M-MLV。
如果不需要全长cDNA，在第一链反应中使用随机引物。 |
| 引物或模板对残余的RNA模板敏感 |
在PCR前用RNaseH处理。 |
| 靶序列在分析的组织中不表达 |
尝试其他靶序列或组织 |
| PCR没有起作用 |
对两步法RT-PCR，不要在PCR步骤中使用超过1/5的逆转录反应产物 |
| PCR灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物 |
PCR引物设计较差 |
避免在引物3'端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构的序列。设计Tm类似的引物。 |
| DNA含有抑制剂 |
诸如DMSO，SDS和甲酰胺之类的试剂会抑制Taq DNA聚合酶。如果怀疑污染了抑制剂，可以使用乙醇沉淀DNA |
| 富含GC的模板 |
对于GC含量＞50％的模板，使用PCRx Enhancer Solution。 |
| 模板浓度太低 |
使用10^4拷贝的靶序列，以在25到30个循环中获得信号。 |
| 镁离子浓度太低 |
从1mM到3mM，间隔0.5mM进行一系列反应，确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。注意：对实时定量PCR，使用3mM到5mM的镁离子浓度。 |
| 退火温度太高 |
使用表4的公式估算Tm，把退火温度设定为低于Tm 5℃。因为这些公式只是估算Tm值，所有真正的退火温度实际会高些或低些。 |
| PCR灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物 |
引物浓度太低 |
最佳引物浓度介于0.1μM到0.5μM之间。为了精确确定引物浓度，在260nm测量光密度，然后使用光吸收值和消光系数计算浓度。（见公式1，2） |
| RT-PCR特异性：在琼脂糖凝胶分析中观察到非预期条带 |
引物和模板非特异性退火 |
在第一链合成中使用GSP，而不是随机引物或oligo(dT)。试用允许高温cDNA合成的GSP。 |
| GSP设计较差 |
遵循用于扩增引物设计的同样原则 |
| RNA中沾染了基因组DNA |
使用扩增级DNaseⅠ处理RNA。使用没有逆转录的对照反应检测DNA污染。 |
| 形成引物二聚体 |
设计在3'端没有互补序列的引物。 |
| 引物和模板非特异性退火 |
以2℃到5℃间隔增加退火温度，减少退火时间。
在开始几个循环使用较高的退火温度，然后使用较低的退火温度。
使用Platinum Taq DNA进行自动热启动PCR。
避免在引物3'端含有2到3个dG或dC。 |
| 镁离子浓度太高 |
对于每一个模板和引物组合优化镁离子浓度。 |
| 因为扩增复杂模板导致引物错误起始 |
使用巢式PCR或递减PCR。 |
| 沾染外源DNA |
使用抗气雾剂的吸头和UDG（见第八章）。 |
| 因为二级结构导致引物结合位点无法接近 |
对于GC含量＞50％的模板，使用（1×-3×）PCRx Enhancer Solution。 |
| PCR忠实性：PCR在产物序列中引入了错误 |
聚合酶忠实性低 |
使用带有校正活性的热稳定聚合酶，如Platinum Pfx DNA聚合酶。 |
| 循环数太多 |
降低循环数。 |
| 四种dNTP的浓度不同 |
制备新的dNTP混合物，保证四种核苷浓度相同。使用预混合物。 |
定量RT-PCR
无扩增产量
相对荧光信号小于等于背景或没有模板对照 |
无cDNA合成 |
|
| cDNA合成温度太高 |
降低保温温度 |
| 反转录cDNA产物被二级结构封闭 |
提高保温温度。重新设计引物 |
| RNA被损害或降解 |
必要的话更换RNA |
| RNAse污染 |
维持无菌条件；加入RNase抑制剂 |
| 荧光探针无功能 |
确保探针设计的有效性和fluorophore和quencher的存在。
用DNase处理TaqMan探针，校验荧光是否增强。
必要的话设计和合成探针。 |
灵敏度低
须在比预期更高的循环中检出产物 |
初始模板RNA不充分 |
增加模板RNA的浓度；使用10ng-1µg的总RNA |
| RNA被损害和降解 |
必要的话更换RNA |
| RNAse污染 |
维持无菌条件；加入RNase抑制剂 |
| 无效的cDNA |
通过增加70％乙醇清洗的次数来去除制备RNA过程中的抑制剂 |
| 无效的PCR扩增 |
注意：反转录的抑制剂包括SDS、EDTA、胍盐、甲酰胺、磷酸钠和亚精胺
调整cDNA合成温度或引物设计 |
信号高于预期
在低于预期的循环中即可检出产物 |
反应中加的样品太多 |
降低模板的浓度 |
| 模板或PCR残余污染 |
隔离污染来源，更换试剂
使用专用的精致移液器。在无DNA区域准备反应，使用抗气溶胶的吸头。 |
| 电泳后出现意外的条带 |
RNA被基因组DNA污染 |
用DNase I预处理RNA |
| 用于第一链合成的寡聚dT或随机引物 |
使用基因特异性引物 |
| PCR的低特异性 |
优化PCR条件 |
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