| 摘要： |
PLATINUM™ pfx DNA聚合酶是一种高保真DNA聚合酶，特别适用于克隆和突变。PLATINUM™ pfx DNA聚合酶的保真性有两种分析来确定，rpsL保真度分析和LacZ保真度分析，并与其它聚合酶相比较。 |
当测定DNA聚合酶的保真度时，保真度数据的变化可能来自不同的分析过程，由于目标中的潜在的突变热点。当评价保真度数据时，保持相似的不是绝对数值而是相对比的酶之间的相对关系。这篇文章用两种分析来评价几种酶的保真度。PLATINUM™ pfx DNA聚合酶具有3’到5’的校正外切酶活性。与其它Taq DNA聚合酶相比具有最低的错误率。 |
方法： |
rpsL保真度分析：pMOL21质粒DNA（4kb），包含氨苄青霉素抗性（Apr）和rpsL基因，用ScaI线性化（图1）。按照制造商的使用说明。进行50微升体积的标准PCR反应，使用2单位Taq DNA聚合酶或PLATINUM™ Taq DNA聚合酶，2.5单位pfu DNA聚合酶或pfu Turbo™ DNA聚合酶，和1.25单位PLATINUM™ pfx DNA聚合酶，使用生物素标记引物AAA AAC GCG TCA CCA GTC ACA GAA AAG CAT CTT AC-3’（正向序列）和AAA AAC GCG TCA ACC AAG TCA TTC TGA GAA TAG-3’（反向序列）。使用1ng模板DNA时进行25个循环，10ng时进行15个PCR循环。PCR反应条件，94℃，2分钟，接94℃ 15秒，58℃ 30秒，68℃ 5分钟的25次或15次循环。百分之二十的反应物用于0.5×TBE的0.8%琼脂糖凝胶电泳，并用0.25μg/ml的溴化乙锭溶液染色。 |
 |
| 图1：rpsL保真性分析的示意图 |
|
确定PCR产物是单一片段后，用链亲和素的磁珠来纯化。简述如下：PCR产物与等体积预洗过的磁珠混合。室温反应15分钟并轻轻旋转混合。离心回收磁珠，重悬于1×High Buffer[50mM Tris-HCl (pH=7.5), 100mM 氯化钠，10 mM 氯化镁，1mM DTT]，并用10个单位的Mlu I，37℃消化过夜以释放PCR产物。磁珠用一个磁性架回收，上清通过一个Micron-100微量纯化筒加以纯化。 |
纯化的PCR产物在一个琼脂糖凝胶上分析，估计DNA浓度和模板加倍数目。DNA用T4 DNA连接酶在16℃连接2小时，然后转化MF101感受态细胞。细胞涂板于含氨苄青霉素的平板（100μg/ml）上来确定转化细胞的总数；涂板于含氨苄青霉素和链霉素（100μg/ml）平板以确定rpsL突变的总数。突变总数除以转化细胞总数来确定突变频率。突变频率除以130（造成rpsL表型变化的氨基酸数目）和模板加倍数来确定错误率。 |
LacZ保真性分析： |
扩增条件，PCR产物纯化条件，连接和转化条件与rpsL分析中使用的一致。但是利用pUC19作为模板；转化DH5 α™细胞。转化细胞涂板在含氨苄青霉素（100μg/ml），X-gal（100μg/ml）和IPTG（1mM）的平板上。突变转化子选择可通过白色克隆的生长来确定。野生型克隆呈现蓝色克隆。如果克隆颜色不清楚可再涂布于氨苄青霉素/X-gal/IPTG平板，37℃培养过夜。突变频率通过突变克隆总数除以转化细胞总数加以确定。错误率通过突变频率除以114（造成LacZ片段α-互补表型改变的氨基酸数目）和模板加倍数目来确定。 |
结果和讨论： |
DNA聚合酶的保真性用两种分析方法来确定。LacZ保真性分析法已经广泛应用于错误率的确定。它是基于测定LacZ基因突变导致其在含X-gal的平板上产生的白色克隆。它需要大面积涂板，它会引入错误并导致不准返募剖
|
| |
收藏
推荐
评论(0条)
