| 方法： |
分离单一细胞 |
在去除了细胞培养基后，COS-7细胞用不含钙镁的DPBS（0.20g/L KCl, 0.20g/L KH2PO4, 8.00g/L NaCl, 2.16g/L Na2HPO4·7H2O）清洗一次。加入Trypsin-EDTA(0.25% tryspsin,1mM EDTA·4Na)到细胞中（3ml/75cm2培养瓶）并保温至最多5分钟。加入20ml生长培养基以终止胰蛋白酶的活性。离心收集细胞。将细胞悬浮到DPBS中至大约1000个细胞/ml。取10μl悬浮液（大约10个细胞）点到清洁的盖玻片表面。用微量移液管在相差显微镜（Nikon Diaphot倒置显微镜，200倍放大）下收集细胞。分离的细胞（在少于1μl的DPBS中）转移到0.2ml薄壁PCR管中。 |
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| 图1. 在显微镜下分离单个细胞 |
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一步法RT-PCR |
使用INVITROGEN的SUPERSCRIPT™ One-Step RT-PCR with PLATINUM® Taq System进行RT-PCR。 |
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| 图2. 源自COS-7细胞的一步法RT-PCR产物。 |
| 1-3泳道分别是从1个，2个和5个细胞中扩增的人类肌动蛋白，使用的是有意义引物（CCT CGC CTT TGC CGA TCC）和反义引物（GGA TCT TCA TGA GGT AGT CAG TC）。C泳道则是没有加入反转录酶的扩增结果。 |
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RT-PCR操作程序
| 向细胞中加入以下成分: |
| 成分 |
量 |
| 2×反应混合物（含0.4mMdNTP, 2.4mM MgSO4的缓冲液） |
25μl |
| 有意义引物（10μΜ） |
1μl |
| 反义引物 （10μΜ） |
1μl |
| SUPERSCRIPT II RT/PLATINUM Taq DNA Polymerase Mix |
1μl |
| 蒸馏水 |
21μl |
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注：对于不加入反转录酶的对照反应，用2个单位的PLATINUM Taq DNA Polymerase代替酶混合物。将反应体系略加震荡以混合均匀，在50℃保温30分钟，然后在90℃保温2分钟。94℃15秒，60℃30秒，68℃1分钟，扩增40个循环。
在含0.5μg/ml溴乙啶的1.2%琼脂糖凝胶上分析10μl PCR产物。 |
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