RNA抽提指南(TRIZOL)

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RNA抽提指南(TRIZOL)

来源：互联网作者：未知发布时间：2006-08-17

2. 分离阶段将匀浆样品在15—30°C条件下孵育5分钟以使核蛋白体完全分解。每1 ml TRIZOL加0.2 ml氯仿。盖紧样品管盖，用手用力摇晃试管15秒并将其在30°C下孵育2—3分钟。在2—8°C下以不超过12,000×g的离心力高速冷冻离心15分钟。离心后混合物分成三层：下层红色的苯酚-氯仿层，中间层，上层无色的水样层。RNA无一例外地存在于水样层当中。水样层的容量大约为所加TRIZOL容量的60%。
3. RNA的沉淀将水样层转移到一干净的试管中，如果希望分离DNA和蛋白，有机层同样要予以保留。通过将水样层和异丙醇混合来沉淀RNA。最初均化时的每1 ml TRIZOL对应0.5 ml异丙醇。将混合的样品在15—30°C条件下孵育10分钟并在2—8°C下以不超过12,000×g的离心力高速冷冻离心10分钟。RNA沉淀在离心前通常不可见，形成一胶状片状沉淀附着于试管壁和管底。
4 .RNA的洗脱移去上层悬液。用75%的乙醇洗涤RNA沉淀一次，每1 ml的 TRIZOL至少加1 ml的75%乙醇。旋涡振荡混合样品并在2—8°C下以不超过7,500×g的离心力高速冷冻离心5分钟。
5. RNA的再溶解在操作的最后，简单干燥RNA沉淀（空气干燥或真空干燥5—10分钟）不要在真空管里离心干燥RNA。尤为重要的是，不能让RNA沉淀完全干燥那样会极大地降低它的可溶性。部分溶解的RNA样品其A260/280比值< 1.6。用移液管尖分几次移取无RNA酶的水或0.5% SDS溶液来溶解RNA，并在55—60°C下孵育10分钟（当RNA以后要用于酶切反应时，避免使用SDS。）RNA还能被100%甲酰胺（除去离子）再溶解并保存在–70°C。

RNA抽提注意事项：
1.从少量的组织(1—10 mg)或细胞(102—104)中分离RNA 样品：往组织或细胞中加入800 µl TRIZOL。待样品裂解后，加入氯仿并进行步骤2中的抽提操作。在用异丙醇沉淀RNA之前，加入5—10μg无RNA酶的脂质体(Cat.No 10814)作为水样层的载体。为降低其黏度在加入氯仿前用26号注射器抽吸两次以切断基因组DNA。脂质体会留在水样层中并和RNA共析出。在浓缩到4 mg/ml之前它不会抑制第一丝状体的合成也不会抑制PCR。
2.在匀化后和加入氯仿之前，样品可以在–60—–70°C保存至少一个月。RNA沉淀（步骤4，RNA洗脱）溶于75%的乙醇在2—8°C至少可以保存一周，在–5—–20°C下至少可保存一年。
3.台式离心机最大能达到2,600×g的离心力，如果将离心时间延长到30-60分钟可以满足步骤2和步骤3中的操作。

疑难解答：

RNA抽提
每1 mg组织或1×106培养细胞预期的RNA产量
1.肝和脾，6—10μg
2.肾，3—4μg
3.骨骼肌和脑组织，1—1.5μg
4.胎盘，1-4μg
5.上皮细胞(1×106 cultured cells)，8—15μg
6.纤维母细胞(1×106 cultured cells)，5—7μg

•抽提得率低
1.样品均化或裂解不完全。
2.终RNA不完全再溶解。

•A260/A280 比率 <1.65
1.在分光光度计测量前用水而不是用TE 缓冲液稀释RNA样品。低离子强度和低pH溶液会增加280 nm处的光吸收值。
2.样品匀浆化时所加的TRIZOL量太少。
3.匀浆化后样品没有在室温下放置5分钟。
4.分离的水样层中污染有苯酚层。
5.终RNA没有完全溶解。

•RNA降解
1.从动物体取下的组织没有立即进行抽提或冰冻保存。
2.用于抽提的样品，或抽提的RNA样品保存于–5—–20°C，而不是存放于–60—–70°C。
3.细胞经胰酶消化而分散。
4.水溶液或试管污染有RNA酶。
5.用于琼脂糖凝胶电泳的福尔马林pH低于3.5。

•DNA污染
1.样品匀浆化时所加的TRIZOL量太少。
2.用于抽提的样品包含有机溶媒（例如，乙醇，DMSO），强缓冲液，或碱性溶液。

•蛋白多糖和多糖污染
下述的对RNA沉淀方法（步骤3）的改进能从抽提的RNA中移去复合污染。以匀浆化时每1 ml TRIZOL为例，在水样层中加入0.25 ml异丙醇后再加入0.25 ml的高盐溶液(0.8 M柠檬酸钠和1.2 M NaCl)。将终溶液混匀，离心并继续进行前述的抽提操作。改进后的沉淀法能有效地析出RNA而多糖和蛋白多糖仍以可溶的的形式留在溶液中。对于含有大量多糖的植物，要抽提其RNA将改进后的沉淀法和在最初匀浆化时多加一次离心(RNA 抽提指南，可选方案)合并使用是十分必要的。共2页: 上一页 [1] 2 下一页

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