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钙调蛋白组分的活性测定 |
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来源：互联网 作者：未知 发布时间：2006-09-01
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开始蛋白质纯化工作
许多科学家还没花多少时间在蛋白质纯化的最初步骤方面仔细考虑，便急急忙忙地在可用来把所需蛋白质与杂蛋白分开的各种层析方法上绞尽脑汁。其实，蛋白质纯化工作一旦开始，首先必须确定有关待研究蛋白质的几个参数。
常常假定生物活性是蛋白质的必然结果，这虽是一种假设，但确实存在大量的、在许多环境条件下具有活性的小分子和大分子。判断是否有蛋白质参与的最好准则是:①对内切蛋白酶的敏感性;②透析时的保留性;③变性剂引起的失活;④化学修饰剂引起的失活。所有这些准则都有例外。虽然大多数蛋白质对蛋白酶如胰蛋白酶等都是敏感的，但也有一些蛋白质保留有抗蛋白酶的核心，它可一直保持住活性，甚至比完整蛋白的活性还高。与小分子不同，蛋白质在透析时应能保留住，当然，这有赖于透析膜的标称截留分子量的额定范围。标称截留分子量范围为1000~30000Da的透析膜已有市售，但分子量接近截留值的蛋白质会因其形状而不能保留。此外，还有一些生物活性可能存在于分子量小于1000Da的肽中，因此，从技术上讲它们是有可能(但现在还不能)透析的蛋白类物质。常用的变性方法是加热或加离液剂(chaotropic agent)如尿素或胍盐离子等。许多蛋白质对加热引起的不可逆失活是敏感的，但也有一些明显的例外，如钙调蛋白，它是热稳定的。而且，离液剂引起的变性在许多情况下是可逆的。某些化学修饰的情况也是如此，特别是二硫键的还原。常用二硫键还原接着烷基化作为一种手段来证明蛋白质与某生物活性有关。不过，不是所有的蛋白质都含有二硫键(如钙调蛋白)或具有依赖于巯基的活性的。最好的办法是在开始纯化之前用多项准则来确定待研究的生物活性是由蛋白质产生的。
建立测活方法
值得重复一提的是纯化的最重要的部分是测活。必须有一种比较快速、简便、定量的测活方法，以实现分离某一特定蛋白质的希望。测活方法的特异性很重要，但事先常可能不知道。通常是在单一活性成分纯化出来后，有了蛋白质的抗血清以及DNA操作如分子克隆和聚合酶链式反应(PCR)等分子生物学手段，才能鉴定结构上相关的分子。不过，这种分析并不能保证相关分子的功能鉴定。有可能存在一些功能相似但结构与原蛋白无关的蛋白质。另一方面，结构上相关的分子也可能会有不同的功能，因而在所用的测活试验中不显示活性。总之，正是通过测活来界定将要纯化的实体。
活性可以通过直接酶促活性、对酶促活性的调制作用(modulation)、与配体的结合能力、与大分子(如另一蛋白质、糖或核酸)的结合能力来测量，或通过细胞、组织或器官的生物活性来量测。这种测量离分子测定法(molecular assay)越远，就越不可能做到快速、省钱和定量。免疫测定法(immunological assay)是非常有用的，因为抗体分子可有极高的特异性。不过，有些抗体能与若干不同分子共有的表位(epitope)起反应。用免疫测定法时，必须记住它的判据是结构性的(即免疫反应性)而不是功能性的。但在某些情况下，抗体可由生物活性的抑制作用来定义。在这种情况下，分离免疫反应性蛋白应能得到功能性分子。当利用配体或大分子结合试验时，重要的是要记住它们测量的是两个(或多个)分子之间的相互作用，而不是特异的酶促活性。例如对于转录因子就是如此，它可通过与DNA的结合作用来分离和测活，但只有到体外和体内实验证明它有转录激活作用时，才能明确地说它就是转录激活因子。
钙调蛋白样品的测活
钙调蛋白能以钙依赖性方式激活多种酶类，包括环核苷酸磷酸二酯酶(PDE)、若干蛋白激酶、蛋白磷酸酶、Ca2+/Mg2+ ATP酶和NAD激酶。我们如何选择一种对监控纯化过程最有用的测活方法?虽然钙调蛋白最初被鉴定为是PDE的激活因子(Kakiuchi和Yamazaki,1970;Cheung,1971)，但现在并没有令人信服的理由在其测活试验中非用这种酶不可。可从牛脑制得部分纯化的PDE制备物，但有几种PDE的活性不是钙依赖性的，它们有可能提高测活试验的本底水平。再者，用PDE测活，与ATP酶和NAD激酶一样，需有一步把核苷酸底物与产物分开的操作。对此种分离可用多种方法，如薄层层析、离子交换层析或其他层析方法，这些在一般实验室里都是容易做到的。但我们仍选择用蛋白激酶测活，因为这种测活方法将产物吸附于磷酸纤维素纸上，可对大量结果进行快速分析。激酶的底物是合成肽，它们可在市场上买到，也可在实验室或中心实验室合成。这一测活方法的特异性在于利用提纯的酶(外加的)及特异的底物肽。钙调蛋白测活中最常用的两种蛋白激酶是Ca2+钙调蛋白激酶Ⅱ和肌球蛋白轻链激酶(MLCK)(Gorecka等，1976;Kennedy和Greengard,1981)。这两种酶有一个优点是它们能在温和的条件下与内源性钙调蛋白分离并纯化，因此被测的组分可反加回去，以测定对钙依赖性激活作用的活性(Lukas、等，1986;Haiech等，1991)。其他的蛋白激酶，如磷酸化酶b激酶，就不大方便，因为它们与内源性钙调蛋白结合得太紧。此外，磷酸化酶b激酶的激活动力学因其调控亚基的磷酸化需要附加条件而变得较为复杂。
在本单元中，钙调蛋白是作为MLCK的钙依赖性激活剂来测活的，MLCK从平滑肌组织分离得到。与横纹肌不同，平滑肌不能利用肌钙蛋白C于肌动球蛋白ATP酶的Ca2+依赖性激活作用及随后的收缩循环。在平滑肌中，肌动球蛋白受调节轻链(regulatory light chain)的磷酸化作用的控制。调节轻链系一结合于肌球蛋白头部的小蛋白
待续>>>>
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