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双向电泳之样品的制备 |
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来源：互联网 作者：未知 发布时间：2006-09-03
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一般性原则：
样品制备是双向电泳中最为关键的一步，这一步处理的好坏将直接影响2-DE 结果。目前并没有一个通用的制备方法，尽管处理方法是多种多样，但都遵循几个基本的原则：
1）尽可能的提高样品蛋白的溶解度，抽提最大量的总蛋白，减少蛋白质的损失；
2）减少对蛋白质的人为修饰；
3）破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作用，并使蛋白质处于完全变性状态。
根据这一原则，样品制备需要四种主要的试剂：离液剂(chaotropes),主要包括尿素（Urea）和硫脲（thiourea）；表面活性剂（sufactants），也称去垢剂，早期常使用NP-40、TritonX -100 等非离子去垢剂，近几年较多的改用如CHAPS 与Zwittergent 系列等双性离子去垢剂；还原剂（reducing agents ），最常用的是二硫苏糖醇（DTT），也有用二硫赤藓糖醇（DTE）以及磷酸三丁酯（TBP） 等。当然，也可以选择性的加入Tris-base,蛋白酶抑制剂（ 如EDTA 、PMSF or Protease inhibitor c℃ktails ）以及核酸酶。
样品的来源不同，其裂解的缓冲液也各不相同。通过不同试剂的合理组合，以达到对样品蛋白的最大抽提。在对样品蛋白质提取的过程中，必须考虑到去除影响蛋白质可溶性和2DE 重复性的物质，比如核酸、脂、多糖等大分子以及盐类小分子。大分子的存在会阻塞凝胶孔径，盐浓度过高会降低等电聚焦的电压，甚至会损坏IPG 胶条；这样都会造成2-DE 的失败。样品制备的失败很难通过后续工作的完善或改进获得补偿。
核酸的去除可采用超声或核酸酶处理，超声处理应控制好条件，并防止产生泡沫；而加入的外源核酸酶则会出现在最终的2D 胶上。脂类和多糖都可以通过超速离心除去。透析可以降低盐浓度，但时间太长；也可以采取凝胶过滤或沉淀/重悬法脱盐，但会造成蛋白质的部分损失。因此，处理方法必须根据不同的样品、所处的状态以及实验目的和要求来进行选择。
样品制备程序：
⒈培养细胞（culture cell）样品处理方法：
培养动物组织细胞由于没有细胞壁，因此可以将细胞收集下来，直接加入裂解缓冲液（Lysis buffer）抽提总蛋白。裂解缓冲液有多种配方，本实验室主要采用如下成份：
(A) 7M Urea，2M Thiourea，4％（w/v）CHAPS，40mM Tris-Base，40mM DTT，2％ Pharmalyte pH 3-10.
其他常用的裂解缓冲液如下：
(B) 9.5M urea, 2%(w/v) CHAPS, 0.8%(w/v) Phamarlyte pH3 -10,1%(w/v) DTT and 5mM Pefabl℃ proteinase inhibitor;
(C) 加入0.3 -1% SDS 在95 ℃ 煮样品5mins ，冷却后加入至少5倍体积的（A）或（B）裂解液。
总蛋白抽提程序：
（1） 培养细胞的收集；
（2） 用磷酸缓冲液（PBS）洗细胞3 次（室温，1000g， 各2min）；
（3） 将细胞分装到1.5ml Eppendof 管中，吸干残留的PBS；
（4） 加入裂解缓冲液（1.5x106 个细胞大约加入100µL 裂解液），在室温振荡1h，使其充分溶解；
（5） 4℃，40,000g，离心1h；
（6） 吸取上清并用Brandford 法定量蛋白，然后分装至Eppendof 管里保存在-78℃ 备用。
组织样品处理方法：
对大多数从动物或植物组织里提取总蛋白质而言，同样没有一种通用的程序。但遵循的原则基本相同。下面列出一种对植物树叶总蛋白的方法。
三氯醋酸－丙酮沉淀法（TCA/acetone precipitation）提取植物树叶总蛋白程序：
（1） 在液氮中研碎叶片；
（2） 悬浮于含10％三氯醋酸（TCA）和0.07%ß-巯基乙醇(可用DTT替代)的丙酮溶液在－20 ℃ 的冰浴；
（3） 让蛋白质沉淀过夜然后离心（4℃，40,000g, 1h），弃上清；
（4） 重悬沉淀浮于含0.07%β -巯基乙醇的冰预冷丙酮溶液里；
（5） 离心（4℃，40,000g, 1h）后真空干燥沉淀；
（6） 用（A）或（B）裂解液溶解沉淀，离心（4℃，40,000g, 1h）。
（7） Brandford 法定量蛋白，然后分装至Eppendof 管里保存在-78℃备用。
超速离心法：
（1）取材；
（2）用研钵在液氮冷冻条件下将样品研成粉末，每1g 样品加入0.5ml 裂解液，使用组织匀浆器匀浆30 s；
（3）组织悬液15℃，10 000×g 离心10 min；
（4）上清液4℃，150 000×g 超速离心45 min；
（5）小心避开上层漂浮的脂质层，吸取离心上清6℃ 40,000g 再次离心50 min；
（6）取离心上清。Bradford 法定量，分装后置–75℃保存。
文献报道较多的裂解液配方
Lysis buffer A
(9 M urea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors)
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Final concentration |
Amount |
| Urea (FW 60.06, Sigma, >99.5%) |
9 M |
10.8 g |
| CHAPS (FW 614.89,Sigma, >98%) |
4% (w/v) |
0.8 g |
| Ultrapure H2O |
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to 20 ml |
prepare fresh or store in aliquots at –20℃
A cocktail of protease inhibitors |
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| DTT(FW 154.25, Promega) |
1% |
13 µL/200 µL Lysis buffer (15.5×stock), -20℃ |
Lysis buffer B
(7 M urea, 2 M thiourea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors)
Lysis buffer C
40 mM Tris-base (pH 9.5) in ultrapure H2O
Lysis buffer D
(8 M urea, 4% CHAPS, 40 mM Tris(base), 40 ml)
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Final concentration |
Amount |
| Urea (FW 60.06) |
8 M |
9.6 g |
| CHAPS |
4% (w/v) |
0.8 g |
| Tris base (FW 121.1) |
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| Ultrapure H2O |
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to 20 ml |
| prepare fresh or store in aliquots at –20℃ A cocktail of protease inhibitors |
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| DTT (FW 154.25,Promega) |
1% |
13 µL/200 µL Lysis buffer (15.5×stock), -20℃
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Lysis buffer E
(5 M urea, 2 M thiourea, 2% SB 3-10, 2% CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors)
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Final conc. |
Amount |
| Urea |
5 M |
3.0 g |
| Thiourea (FW 76.12) |
2 M |
1.52 g |
| SB 3-10 (FW 307.5) |
2% |
0.2 g |
| CHAPS |
2% |
0.2 g |
| Ultrapure H2O |
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to 10 ml |
| A cocktail of protease inhibitors |
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| DTT (FW 154.25,Promega) |
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1% 13 µL/200 µL Lysis buffer (15.5×stock), -20℃ |
Lysis buffer F
100 µL SDS sample solution (1% w/v SDS, 0.375 M Tris-HCl, pH 8.8, 50 mM DTT,25% v/v glycerol
注：CA、蛋白酶抑制剂混合物和DTT在临用前加入。
广谱蛋白酶抑制剂混合物（如加tris 可不用此混合物）
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成分 |
终浓度 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 |
PMSF |
35 µg/ml or 1 mM |
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EDTA |
0.3 mg/ml (1 mM) |
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抑肽素 |
0.7 µg/ml |
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亮肽素 |
0.5 µg/ml |
其中C-F 是分步法提取的4 种裂解液配方, C 适于提取水溶性蛋白，D是经典配方，E适于提取膜蛋白配方，F 适于提取难溶的沉淀蛋白。
欲了解更详细的样品制备信息，可参考：
http://us.expasy.org/ch2d/protocols/protocols.fm1.html.
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