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PCR产物测序 --利用核酸外切酶 I和热敏磷酸酶去除引物和dNTPs
去除引物和dNTPs试试核酸外切酶Ⅰ和热敏磷酸酶!
PCR反应完毕后,产物里通常还混有PCR引物和过量的dNTPs--如果产物还要进行测序,那你一定要去除它们!
通常我们采用胶回收的方法提纯PCR产物,可是胶回收法不仅成本高,麻烦,而且还意味着一定量的产物损失。
现在,你可以利用NEB提供的核酸外切酶 I和热敏磷酸酶简单、方便地去除多余的引物和dNTPs。
实验步骤:
- 取出7.5 μl PCR反应混合物;
- 在反应混合物中加入0.5 μl (10 units)的核酸外切酶 I (20,000 units/ml), 37°C反应15分钟;
- 再加入1μl的10× AP Buffer 和1μl (5 units) 热敏磷酸酶,37°C反应15分钟;如果反应时间延长,可减少酶用量,需试验验证。
- 热失活核酸外切酶 I和热敏磷酸酶:80°C保温20分钟,终止反应。
- 反应物可直接用于测序。
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