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2． 试剂
贮液配制方法见表2。
表2 聚丙烯胺凝胶电泳贮液配制方法
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序号
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试 剂 名 称
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配 制 方 法
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1
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1.5％琼脂
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1.5g琼脂，100mL pH8.9分离胶缓冲液浸泡，用前加热溶化。
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2
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分离胶缓冲液，pH8.9
(pH8.9 Tris-HCl缓冲液)
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取48 mL 1mol/L HCl，Tris36.8g，用无离子水溶解后定容至100 mL。
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3
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浓缩胶缓冲液，pH6.7
(pH6.7 Tris-HCl缓冲液)
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取48 mL 1 mol/L HCl，Tris 5.98g，用无离子水溶解后定容至100 mL。
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4
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分离胶丙胶贮液
(Acr-Bis贮液Ⅱ)
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Acr 28.0g，Bis 0.735g，用无离子水溶解后定容至100 mL，过滤除去不溶物，装入棕色试剂瓶，4℃保存。
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5
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浓缩胶丙胶贮液
(Acr-Bis贮液Ⅰ)
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Acr 10g，Bis 2.5g，用无离子水溶解后定容至100 mL，过滤除去不溶物，装入棕色试剂瓶，4℃保存。
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6
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10％过硫酸铵溶液（Ap）
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10g过硫酸铵溶于100 mL无离子水中(当天配制)。
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7
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四甲基乙二胺（TEMED）
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原液。
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8
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核黄素溶液
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核黄素4.0mg，无离子水溶解后定容至100mL。
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9
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电极缓冲液，pH8.3
(pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液)
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Tris 6 g，甘氨酸28.8 g，溶于无离子水后定容至1 000 mL，用时稀释10倍。
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10
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40％蔗糖溶液
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蔗糖40 g，溶于100 mL无离子水中。
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11
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pH4.7乙酸缓冲液
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乙酸钠70.52 g，溶于500 mL蒸馏水中再加36 mL冰乙酸，蒸馏水定容至1 000 mL。
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12
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7％乙酸溶液
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19.4 mL 36％乙酸稀释至100 mL。
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13
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样品提取液，pH8.0
(pH8.0 Tris-HCl缓冲液)
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Tris 12.1 g，加无离子水1 000 mL，以HCl调节pH至8.0
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14
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0.5％溴酚蓝溶液
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0.5 g溴酚蓝溶于100 mL无离子水中。
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15
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联大茴香胺染色液
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联大茴香胺250 mg溶于140 mL 95％乙醇中，加20 mL蒸馏水，使用前加3％H2O2 4～5 mL（当天配制）
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四、操作步骤
1．贮液配制
按上表配制贮液，但应注意
（1）配好的贮液用棕色瓶盛装置冰箱内保存，可放1～2个月。
（2）过硫酸铵应当天配制。
（3）如有不溶物要过滤。
（4）显色液用前再混和。
（5）电极缓冲液用时稀释10倍。
2．电泳槽的安装
垂直板电泳槽的式样很多，目前流行的是用有机玻璃做的两个“半槽”组成的方形电泳槽，中间夹着凝胶模子，是由成套的两块玻璃板装入一个用硅酮橡胶做成的模套而构成，由硅酮橡胶套决定两玻璃板之间距离约为1.5mm，形成一个“胶室”，胶就在这两板之间的胶室内聚合成平板胶。当凝胶模子与两半槽固定在一起后，凝胶槽子两侧形成前后两个槽，供装电极缓冲液和冷凝管用。
将两块玻璃板用去污剂洗净，再用蒸馏水冲洗，直立干燥（勿用手指接触玻璃板面，可用手夹住玻璃板的两旁操作），然后正确放入硅胶条中，夹在电泳槽里，按对角线顺序旋紧螺丝，注意用力均衡以免夹碎玻璃板。安装好电泳槽用pH8.9缓冲液配制的1.5％琼脂溶液封底，待琼脂凝固后即可灌制凝胶。
3． 凝胶的制备
将贮液由冰箱取出，待与室温平衡后再配制工作液。
（1）按表3比例配制分离胶
将分离胶沿长玻璃板加入胶室内，小心不要产生气泡，加至距短玻璃板顶端3cm处，立即覆盖2～3mm的水层（或水饱和正丁醇），静置待聚合（约40min），当胶与水层的界面重新出现时表明胶已聚合。
（2）按表4比例配制浓缩胶
注：TEMED在灌胶前加。
先倒掉分离胶上的水层，立即加入浓缩胶，插入梳子（即样品槽模板），待胶凝后，小心取出梳子。将稀释10倍的电极缓冲液倒入两槽中，前槽（短板侧）缓冲液要求没过样品槽，后槽（长板侧）缓冲液要求没过电极，备用。
4．样品的制备
称取小麦幼苗茎部0.5 g，放入研钵内，加pH 8.0提取液1 mL，于冰水浴中研成匀浆，然后以2 mL提取液分几次洗入离心管，在高速离心机上以8 000r/min离心10min，倒出上清液，以等量40％蔗糖及1/5体积溴酚蓝指示剂混和，留作点样用。
5．点样
用微量注射器（50μL）吸取少量样液，在浓缩胶上层点样，每个点样槽15～50μL。点样时须小心，防止样品液的扩散。
6．电泳
将电泳槽放入冰箱，接好电源线（前槽为负极）。打开电源开关，调节电流到20mA左右，样品进入到分离胶后加大到30mA，维持恒流。待指示染料下行到距胶板末端1cm处，即可停止电泳。把调节旋扭调至零，关闭电源，电泳约3h。
7．剥胶
取出电泳胶板，去掉胶套，掀开玻璃，去掉浓缩胶，用玻棒协助将分离胶放到盛有pH4.7的乙酸缓冲液的大培养皿中浸泡10min。
8．染色、记录结果
倒去乙酸缓冲液，加联大茴香胺染色液，使淹没整个胶板，于室温下显色20min，即得到过氧化物酶同工酶的红褐色酶谱。该酶活性染色过程如下：过氧化物酶分解H2O2产生氧基，后者使联大茴香胺发生反应生成褐色化合物。所以用染色液浸泡凝胶时，有过氧化物酶同工酶蛋白质条带的部位便出现褐色的谱带。
倒掉染色液，重新加入7％的乙酸溶液，于日光灯下观察记录酶谱，绘图或照相。
五、附注
1．如果室温较高，可适当减少电流，延长电泳时间，或采取降温措施，以免温度过高造成酶活损失。
2．工业纯丙烯酰胺（Acr）和甲叉双丙烯酰胺（Bis）的纯化方法
（1）Acr的纯化
称取70g的Acr，于50℃溶于1 000L三氯甲烷（A.R.）中，趁热过滤，冷至－20℃，使结晶，于冷处用布氏漏斗抽滤，用冷的三氯甲烷短时间冲洗，继续抽滤，收集结晶，在真空干燥器中彻底干燥。将白色纯结晶保存于棕色瓶中，熔点为84.5±0.3℃。
（2）Bis的纯化
称取12g的Bis溶于40～50℃的1 000L丙酮（A.R.）中，趁热过滤，慢慢冷至－20℃，于冷处过滤或离心收集结晶。用冷丙酮洗涤后，真空干燥。白色结晶保存于棕色瓶中。
六、思考题
1． 电泳要求的基本条件有哪些？
2． 丙烯酰胺凝胶电泳的制胶过程中，哪些因素影响胶的凝聚？
3．电泳系统的不连续性表现在哪几个方面？存在哪几种物理效应？
4．简述酶活性染色的过程？
参考答案
1．电泳的基本条件为：（1）电泳应尽可能在恒温条件下进行。（2）选用一定pH的缓冲液。同时，所选用的pH以能扩大各种被分离物质所带电荷量的差异为好，以利于分离各种成分。（3）有效迁移率还受电渗现象的影响，电泳时应避免用高电渗物质作支持介质。（4）选用离子强度适宜的溶液。一般最适的离子强度在0.02～0.2之间。
2．TEMED在低pH时失效，会使聚合作用延迟；冷却也可使聚合速度变慢；一些金属抑制聚合；分子氧阻止链的延长，防碍聚合作用。这些因素在实际操作时都应予以控制。以光敏感物核黄素（VB2）作为催化剂进行光聚合时，应避免过量氧的存在。
3．系统的不连续性表现在以下几个方面：（1）凝胶板的上、下两层凝胶的孔径不同，上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。（2）缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同。本实验采用碱性系统。电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl缓冲液。而分离胶为pH8.9的Tris-HCl缓冲液。（3）在电场中形成不连续的电位梯度。在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即电荷效应、分子筛效应和浓缩效应。在这三种效应的共同作用下，待测物质被很好地分离开来。
4．该酶活性染色过程如下：过氧化物酶分解H2O2产生氧基，后者使联大茴香胺发生反应生成褐色化合物。所以用染色液浸泡凝胶时，有过氧化物酶同工酶蛋白质条带的部位便出现褐色的谱带。
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