基本原理

玫瑰花环试验是体外检测人和动物细胞免疫功能的一种方法。E—玫瑰花环试验是T淋巴细胞计数的一种重要方法。由于人和动物的T淋巴细胞表面有红细胞受体，因此红细胞可以粘附到T淋巴细胞的周围而形成玫瑰花样的细胞团。在红细胞中，以绵羊红细胞最为常用。B淋巴细胞则没有红细胞受体，所以不能形成E—玫瑰花环，以资鉴别。

材料与试剂

1．肝素抗凝剂

2．淋巴细胞分层液 配制方法见细胞分离技术。

3．无Ca2 、Mg2 Hank’s液

NaCl 4.00g

NaHCO3 0.175g

KCl 0.20g

Na2HPO4.12H2O 0.076g

KH2PO4 0.030g

葡萄糖 0.50g

H2O加至 500.00ml

用5.6％NaHCO3调pH至7.2，115℃15min灭菌。4℃贮藏备用。

4．5.6％NaHCO3液

NaHCO3 5.60g

H2O 100.00ml

115℃20min灭菌, 4℃贮藏备用。

5．0.8％戊二醛溶液

25％戊二醛溶液 0.32ml

Hank’s液 9.68ml

用前配制。

6．Giemsa—weight染色液

Giemsa粉 0.03g

Weight粉 0.30g

甲醇 100.00ml

先将染料一起放入研钵内，加入少量甲醇，研磨细，然后倒入瓶内，并用甲醇冲洗研钵内染料，一起倒入玻瓶内，补足甲醇量，备用。

操作方法

1．取肝素抗凝血2ml，置37℃水浴自然沉淀30min～40min，吸取全部血浆（约1ml）。

2．于血浆中加Hank’s液数毫升，洗涤，1 500r/min离心5min～10min，弃上清。重复洗涤4次，沉淀均匀即为淋巴细胞悬液。

3．采绵羊肝素抗凝血，加数倍Hank’s液，洗涤3次，最后以Hank’s配成10％悬液，4℃保存。

4．取0.1ml淋巴细胞悬液，加10％红血球悬液0.1ml，加小牛血清0.1ml。

5．37℃水浴10min，低速离心（600r/min）5min。

6．吸弃多余的上清液后，放入4℃冰箱2h～4h。

7．取出后，将沉淀轻轻摇起，加0.8％戊二醛0.1ml，混匀后4℃固定15min。

8．将干净的玻片用Hank’s液沾湿，滴一小滴混悬液，让其自然散开即可。

9．自然干燥后，用姬姆萨—瑞氏液（Giomsa—weight）或苏木精—伊红染色，水洗，干燥镜检。

结果判定

凡一个淋巴细胞结合3个或3个以上的红细胞者为一个E—玫瑰环。检查200个淋巴细胞，计算其玫瑰花环形成率。

注意事项

1．影响E—玫瑰花环试验最主要的因素淋巴细胞和红细胞的新鲜程度，被检血样必须新鲜，无菌，采血后要求在3h～4h内进行检验，否则由于淋巴细胞的死亡，受体脱落，影响检查结果。红细胞用阿氏液保存最多不要超过3周，且不应溶血。

2．控制好反应温度、时间等条件对玫瑰花环形成率有较大影响。选37℃作用10min，低速离心5min，置4℃ 2h～4h，其结果稳定性较好，结合率较高。如在37℃作用时间较长，可见玫瑰花环发生变形，结合部位松弛、拉开，甚至解离。

3．指示红血球的动物种类也与玫瑰花环的形成率有关。如马淋巴细胞与豚鼠红细胞结合较好，而驴则与绵羊红血球结合较好。Melinda氏报道，人、马、牛、猪、狗、猫、鼠与豚鼠红细胞的结合率都高于绵羊红细胞的结合率。

4．加犊牛血清能增加玫瑰花环形成细胞的稳定性，增强与指示红细胞结合的牢固性。

5．Hank’s液的pH以7.2～7.4为宜。