材料与方法

1．抗原动物及免疫方法 抗原为哈尔滨兽医研究所保存的马传贫病毒株培养物制备的可溶性抗原。免疫动物为6～8周龄的Balb/c鼠。初次免疫用含完全佐剂抗原0.2ml（病毒含量为1.0×108／ml制备的可溶性抗原）腹腔接种，经2周再次免疫接种，应用不完全佐剂抗原0.2ml腹腔接种，再经3周强化免疫，接种可溶性抗原0.3ml，3天后取脾脏。

2．细胞培养 SP2/0鼠骨髓瘤胞株，培养液为含0.025Mol/L HEPES的RPMI－1640（pH7.3），另加新生牛血清15％NEAA液1％，丙酮酸钠（1.1％）和谷氨酰胺（2.92％）各1％，青链霉素（100U或µg/ml）1％，39℃CO2培养箱中孵育，CO2浓度为5％。

3．细胞融合及克隆化 取SP2/0鼠骨髓瘤细胞1.0×107/ml和脾细胞2.0×107个/ml，离心沉淀弃上清，然后向细胞沉淀中加入细胞融合剂0.7ml（50％PEG 4 000），按常规细胞融合程序进行。用HAT完全培养基做稀释，培养在事先加有饲养细胞的24孔细胞培养板中，经7天具有杂交瘤细胞增殖，形成有数十个细胞菌落。当对其培养上清液检查抗体为阳性时，以96孔培养板有限稀释法和钢杯法将细胞做克隆化培养和增殖，然后转入细胞培养瓶中进行常规传代培养。

4．抗体检测及鉴定
(1) ELISA法：HRP标记兔抗鼠Balb/c结合物（北京生物制品研究所购买），用MR580微量ELISA自动读数仪判读结果。

(2) IF法：直接法用兔抗鼠Balb/c IgG荧光抗体诊断血清对杂交瘤细胞染色，对照用SP2/0细胞，间接法用感染马传贫病毒的驴胎皮肤细胞及其正常驴胎皮肤细胞分别载于涂片上丙酮固定后，加A4、A5及C4培养物上清液，置37℃30min，然后用PBS洗涤三次，再用兔抗鼠Balb/c IgG荧光抗体诊断血清，置37℃30min，PBS洗涤3次，荧光显微镜下观察，并用SP2/0细胞培养物上清做阴性对照。镜下细胞呈绿色荧光者判为阳性。

(3) 琼脂免疫双扩散法

(4) SDS—PAGE法

(5) McAb的纯化，以杂交瘤细胞无血清培养液和腹水做SPA－Sepbarosecl－4B亲和层析。

(6) 杂交瘤细胞染色体的检测

(7) 中和试验和补体结合试验

结果

1．杂交瘤细胞的筛选 融合后的细胞接种在24孔细胞培养板上，第7天融合细胞开始增殖，经ELISA和IF筛选，获得A4、A5及C4三个分泌马传贫病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株。

2．马传贫杂交瘤细胞的染色体组型分析 SP2/0骨髓瘤细胞染色体数为72，Balb/c鼠脾细胞染色体数为40，杂交瘤细胞系A4为97.80±3.87；A5为 100.93±5.50；C4为98.10±4.47。

3．马传贫杂交瘤细胞分泌抗体的动力学 对A 4、A5 和C4三株杂交瘤细胞1~60代培养上清液进行了ELISA检测，A4、A5两株抗体分泌较为稳定，C4株的抗体分泌有逐渐减少的趋势。

4．马传贫杂交瘤细胞分泌抗体的特异性 以A 4、A5 和C4杂交瘤细胞培养液分别给Balb/c鼠腹腔接种后引起的腹水及该鼠的抗血清同马传贫病毒（辽系毒和黑系毒）。能感染马匹的乙脑病毒和同为逆转录病毒科的牛白血病病毒抗原进行ID、CF及ELISA检测，仅见同马传贫抗原呈阳性反应，其余皆阴性。