（一）材料及试剂

1．器材

⑴细胞培养板：灭菌的国产96孔或40孔平底聚苯乙烯塑料板或进口96孔细胞培养板。

⑵50μl、100μl、300μl微量加样器，灭菌的塑料滴头。

⑶无菌透明胶带，其密度与塑料板一致。

⑷灭菌的离心管

⑸倒置显微镜

2．IBR Baitha—Nu/67弱毒株冻干毒，标准阳性血清，标准阴性血清，均由指定单位供应。

3．细胞培养液

Eagles MEM 45％

0.5％水解乳蛋白－Earle液 45％

犊牛血清 10％

谷氨酰胺 0.03％

青、链霉素各200μg/ml

用7％NaHCO3液调pH6.8～7.0。

（二）操作方法

1．细胞制备 灭菌采取犊牛肾或睾丸，按常规胰蛋白酶消化法制备牛肾（BK）或睾丸（BT）细胞，置37℃温箱培养，长成良好单层细胞备用。一般使用次代细胞，但不超过4代。

2．病毒抗原制备 将IBR Baitha—Nu/67弱毒株冻干毒用LE（0.5％水解乳蛋白—Earle液）作10倍稀释，取长成良好的单层细胞（BK或BT），用Earle’s液洗一次后，按原培养液1／10的量接毒。置37℃温箱吸附1h，然后加入pH7.1～7.2含青、链霉素200g/μgml的LE液至原培养液量，37℃培养，待80%～90％出现典型IBR病变时收获培养物，冻融2次后，3 000r/min离心10min，其上清即为病毒抗原。测定病毒滴度（TCID）并分装小瓶，贮于-70℃备用。半年内滴度保持不变。

3．病毒滴度测定 将制备的病毒抗原，用pH7.0～7.2的LE液作10倍递增稀释至10-7，每病毒稀释滴度液接种细胞培养板4孔，每孔50μl，随后每孔加入细胞悬液（50～60万细胞／ml）10μl和细胞培养液50μl。设4孔细胞对照。用透明胶带封板，置37℃培养。观察1周，每天记录细胞病变情况。

细胞培养半数感染量（TCID50）的确定按Reed-Muench方法计算，即：

TCID50＝高于50％死亡率的病毒稀释度的对数 距离比值×稀释倍数（10）的对数。

4．无菌采集被检血清，不加任何防腐剂。各种血清均56℃灭能30min。

5．将一瓶已知滴度IBR病毒抗原，用pH7.0～7.2的LE液稀释成100TCID50／0.05ml，取0.3ml与等量的被检血清于小试管中，37℃温箱中和1h。

6．将已中和的被检血清—病毒混合液加入培养板孔中，每个样品接种4孔，每孔100ul。再于每一样品孔中加入100μl细胞悬液，用透明胶带封板，37℃培养。

7．每次试验时，均设立以下对照：

(1) 标准阳性血清 抗原，标准阴性血清 抗原，其操作程序同试验组。

(2) 被检血清毒性对照：每份被检血清样品接种2孔，每孔50μl，补加细胞培养液50ml，再加细胞悬液100μl。

(3) 细胞对照：每孔加100μl细胞悬液，补加细胞培养液100μl。

(4) 实际使用病毒抗原工作量的测定：将病毒抗原工作溶液（100TCID50／0.05μl）作10倍递增稀释至10-3，每个稀释度接种4孔，每孔50μl，补加细胞培养液50μl，再加细胞悬液100μl。计算本次试验每0.05ml中TCID50的实际含量。

（三）结果判定

1．接种后72h判定结果 当病毒抗原工作液对照、标准阴性血清对照均出现典型细胞病变。标准阳性血清对照无细胞病变，被检血清对细胞无毒性，细胞对照正常病毒抗原实际含量在30～300TCID50时，方能判定，否则被认为无效。

2．判定标准 未经稀释的被检血清能使50％或50％以上细胞孔不出现病变者判为阳性。