（二）放射免疫检测与免疫放射检测(即IRMA与RIA)的区别
见表13－4。
表13－4 IRMA与RIA的区别
|
IRMA
|
RIA
|
|
|
标记物质
|
抗体
|
抗原
|
|
标记物用量
|
过量
|
限量
|
|
反应方式
|
直接结合
|
竞争性结合
|
|
B、F分离方式
|
固相抗原免疫吸附剂
|
第二抗体等
|
（三）标记抗体的制备
特异性抗体的制备，质量要求及125I标记方法与RIA基本相同。抗体IgG分子中含有多个氨基酸残基，经过碘化反应后，不影响其免疫学活性，并能结合上较多的碘原子，标记物的比放性高，克服了RIA中某些抗原不易标记，或在标记过程中容易发生化学或放射性损伤等缺点。同时纯化的抗体比抗原的纯品来源更为丰富。标记抗体的方法比较单一，也易于掌握，不同于标记抗原，每一种抗原必须标记一次，且抗原复杂，多种多样，标记方法也多种多样。如果将抗体分子酶解成Fab片段，形成单价抗体，再进行标记，这样其敏感性将显著高于一般的IRMA。
（四）免疫吸附剂的制备
免疫吸附剂是将高纯度的抗原连接在固相载体上而制成。所用固相载体要求对抗原的结合力强，对非特异性蛋白质的吸附性能低，且具有高度的分散性，这样才能大量地结合特异性抗体。一般采用重氮化的纤维素、溴化氰化的纤维素、琼脂糖4B珠、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝胶和玻璃粉等作为抗原吸附剂的固相载体。
近年来发展建立的双抗体夹心IRMA法，用固相抗体代替抗原免疫吸附剂，反应后形成固相抗体-抗原-标记抗体复合物，经过洗涤即可除去游离的剩余标记抗体，简化了分离步骤，并保证了较高的特异性。
固相抗体的制备方法有两种：一种是物理吸附法，将塑料小珠浸泡在稀释的抗体中，用前经过洗涤即可。或者将抗体吸附在塑料试管中；另一种是采用化学连接法，将抗体较牢固的结合，这样洗涤时不易脱落，塑料小珠浸泡的条件是50mMol/L pH9.5碳酸盐缓冲液，抗体的浓度为IgG 0.1μg/ml～100μg/ml。塑料试管吸附抗体的条件是抗体浓度0.1μg/ml～100μg/ml 37℃、4h～6h或4℃ 24h。
（四）测定方法
根据试验设计的特点，可分为以下几种类型。
1．直接IRMA法 将待测抗原与过量的标记抗体进行温育，使二者结合。然后加入固相抗原免疫吸附剂再次温育，吸附游离的标记抗体。离心去除沉淀物，测定上清液中放射性强度。根据标准曲线即可得知待测样品中的抗原含量。
2．双抗体夹心IRMA法 在待测抗原内依次加入固相抗体(或将待测品直接加入抗体包被管内)和标记抗体，反应后形成固相抗体(Abl)－抗原－标记抗体(Ab2)复合物。洗涤除去未结合的游离标记抗体。测定固相抗体或载体上免疫复合物的放射活性，根据标准曲线求得待测得抗原量。此法仅适用于检测有多个抗原决定簇的多肽和蛋白质抗原。
3．间接IRMA法 此法是在上述双抗体夹心法的基础上，进一步改良为125I标记Ab2的抗体，反应形成的固相抗体(Ab1)－抗原－Ab2－标记抗体(
收藏
推荐
评论(0条)
