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荧光抗体的制备 |
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来源：互联网 作者：未知 发布时间：2006-09-24
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（一）免疫球蛋白的提取
（二） 荧光素
1． 荧光色素的基本条件
（1） 具有化学活性基团，如异硫氰基（-NCS）等，易与免疫球蛋白结合形成共价键。
（2） 对免疫球蛋白无毒性，不影响抗体活性。
（3） 荧光效应高，与蛋白结合需要量少。
（4） 荧光素性能稳定，结合物性能稳定，容易贮藏。
（5） 结合物的颜色必须与背景组织有良好的反衬作用，易于观察判定。
到目前为止，基本符合上述要求的荧光素只有异硫氰酸荧光素（FITC），丽丝胺罗丹明B200（RB200）。
2．常用的荧光色素
（1）异硫氰酸荧光素 ：又称异硫氰酸荧光黄，纯品为橙黄色粉末。分有结晶型与粉末型两种,结晶型荧光强度大、稳定、优于粉末型。分子式C21H11O2N5、分子量389，溶于水，易溶于pH8-9.5碳酸盐缓冲液中。最大吸收波长为495nm。最大发射波长520nm。异硫氰酸荧光黄性质稳定，于低温下可保存二年以上，但久置标记抗体能力弱，荧光亮度差，故应采用新产品。
异硫氰酸荧光素借助异硫氰基与蛋白中氨基酸（主要是赖氨酸）的氨基结合。一个IgG分子有86个氨基酸残基，一般最多能标记16～20个荧光素分子。
（2）丽丝胺罗丹明：为褐色粉末，不溶于水、易溶于酒精和丙酮。荧光为桔红色。性质稳定，可长期保存。分子式C23H29O7NaS2，分子量为580，最大吸收波长570nm，最大发射波长为600nm。
由于丽丝胺罗丹明荧光效能较低，一般不单独使用，多用于与FITC标记抗体的反衬染色或双标记配合使用。此染料不能直接与蛋白质结合，必须先用五氯化磷（PCl5）处理，使染料的-SO3Na基变为-SO3Cl基后，才能在碱性条件下与赖氨酸的氨基结合，形成稳定的硫氨键。
（三） 标记方法
异硫氰酸荧光素常用的标记法有以下两种：
1． 搅拌法
（1）取一定量的纯IgG液，用0.5Mol/L pH9.5碳酸盐缓冲液稀释至20mg/ml。
（2）按荧光素与蛋白质比1
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