（一）制片
选无自发性荧光的石英玻片或普通优质玻片，洗净后浸泡于无水乙醇和乙醚等量混合液中。用时取出用绸布擦净。将待检样品如组织块剪成适当大小印压于玻片上。也可采用冰冻切片或石蜡切片样品。

（二）固定

除研究细胞表面抗原或不稳定抗原可不固定外，一般均应固定。固定的作用有三：①防止标本从玻片上脱落；②除去防碍抗原—抗体结合的类脂，使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果；③固定的标本易于保存，如组织切片固定后在-20℃下可保存一年而不改变其染色特性。

标本的固定原则是：①不能损伤细胞内的抗原；②不能凝集蛋白质；③不能损伤细胞形态；④固定后应保持细胞膜的通透性，以允许抗体进入与抗原结合。

表 常用抗原物质的固定方法

抗原物质		固定剂		固定条件（min）
蛋白质抗原		95%～100%乙醇		室温3～10
酶、激素		丙 酮		4℃ 30
免疫球蛋白		四氯化碳
病 毒		丙酮、四氯化碳、无水乙醇		室温5～10或4℃ 30～60
多糖、细菌等		微火加热，甲醇、10%甲醛、丙酮		室温5～10或4℃ 30～60
类 脂 （异嗜性抗原）		10%甲醛，10%佛茂尔（ForMol）		室温3～10

（三）水洗

固定后以冷的0.01Mol/L pH7.4PBS液浸泡冲洗，最后以蒸馏水冲洗，防止自发性荧光。

（四）染色

染色分直接染色法与间接染色法。

1． 材料与试剂

（1）荧光抗体，稀释至应用浓度。

（2）0.01Mol/L pH7.4PBS液

（3）9份优质甘油加1份pH7.4PBS液即为甘油缓冲液。甘油有减少非特异性荧光的作用。

（4）带盖方盘

2．直接染色法

（1）将固定好的玻片置于湿盘中，滴加荧光抗体染色液，以覆盖为度，加盖，37℃感做30 min～45min。

（2）PBS冲洗3次，每次冲洗3min，即3×3