粒细胞一个最明显的特点是改变了细胞的有氧代谢，当遭遇吞噬颗粒，或者是细胞膜的干扰试剂，诸如趋化因子，变性剂，凝集素，以及其它的一些细胞表面配体，粒细胞以及单核噬菌细胞在氧气消耗上就会发生了较大的改变，主要表现在过氧离子， H 2 O 2 ，氢氧根离子等的产生。这样的事件称为"呼吸爆发"。当巨噬细胞被激活后，并且主要在抗菌和抗癌反应中，其挽救呼吸爆发的能力会发生改变。而且，随着体外单核细胞的分化，H 2 O 2 的产生也会应之改变。因此，可以把H 2 O 2 的水平，作为评判嗜中性细胞，嗜酸性细胞的代谢能力以及巨噬细胞是否成熟和是否处于激活状态的标准参数。这里我们谈的是两个医疗诊断方面的工作，都涉及体外定量。首先，在慢性肉芽肿病中，发现它是由于H 2 O 2 产生的组件遗传缺陷，对个体中分离的细胞所释放的H 2 O 2 加以定量，将成为非常有价值的医疗参数。其二，粒细胞挽救呼吸爆发的能力在肿瘤的提前诊断方面具有重要的意义，用它可以评价巨噬细胞、嗜中性细胞、嗜酸性细胞等侵染后，肿瘤细胞的代谢状态，这项技术可以用来追踪肿瘤组织炎症的发生情况。当前优选的鉴定H 2 O 2 产生的方法是基于利用荧光技术。但是，当对大量样品的H 2 O 2 的释放进行检测，原始的荧光技术就不再是一个有效和可靠的方法，而且它还需要足够量的细胞才能取得重复性的结果。在本论文中，我们提出了一个改良的荧光技术，也就是将荧光技术与96孔板模块结合，因此解决了传统的实验技术带来的效率低的问题。

在本地的血库中从健康捐献者那里获得了 ACD抗体耦连的血液。取后右旋糖苷处理的富含白细胞的血浆，在Ficoll-Paque上800g离心20分钟，在血浆和Ficoll的界面上含有淋巴细胞和单核细胞,收集它们，加在96孔板上（GREINER，COSTAR或者FALCON）。然后在37℃下温育2个小时，使得单核细胞吸附在培养室的底部，将淋巴细胞洗去，留下单核细胞培养在标准环境下。Ficoll方法分离后余下的红血球用超声波裂解。裂解的细胞重悬在Krebs- Ringer磷酸缓冲液（KRP），pH 7.4 （ 122 mM NaCl, 0.5 mM CaCl 2 , 1.2 mM MgCl 2 , 16.7 mM 磷酸缓冲液, pH 7.4, and 5 mM 葡萄糖）。然后通过3-甲氧基-4-羟基苯乙醛酸的方法（HVA）（2），可以用荧光测量释放的H 2 O 2 的水平。该方法是将细胞培植在96孔板中，达到每孔中有100，000个细胞，然后加入100ml的KRP，KRP缓冲液中含有0.4M HVA，10μg/L辣根过氧化物酶，1mM NaN以及用作激活剂的佛波脂PMA（50ng/ml）。用装有一套发射波长为320nm、吸收波长为425nm滤光片的微孔板荧光仪，在不同时间，检测其发出的荧光。通过已知浓度的H 2 O 2 制作标准曲线，按照标准曲线，将所测算的荧光值转换成纳摩尔为单位的H 2 O 2 。利用改进的"爆发"软件修订版，完成数据的分析和统计。

图一（下图一）所示的样本是从两个健康的人身上取得的，一类是由单核细胞分化后变成的的巨噬细胞，并且已经培养了 3天，另一类是嗜中性粒细胞。分别用PMA刺激不同时间，测量它们所产生的H 2 O 2 。这次检测显示，从两个供试个体取得的细胞样本释放的H 2 O 2 的水平相当，而正如预期的结果，嗜中性粒细胞对佛波脂PMA的应答要比巨噬细胞更为明显。图二（下图二）所示的是另一组数据。实验用单核细胞衍生的巨噬细胞，并培养4天后，在细胞培养物中加入100U/ml的IFNγ和50ng/ml的LPS，分别取处理24小时和72小时的样本，测量释放的H 2 O 2 的水平。在这两种处理方案中，H 2 O 2 的释放都急剧增加，并且经LPS刺激后，增加的幅度更为明显。

这个实验提出了一种简单快速可行的方法，用它可以检测由呼吸爆发导致的新分离的或者已经培养过的白细胞中释放的 H 2 O 2 。这种方法是基于微孔板技术，用以分析HVA诱导产生的荧光。使用 SPECTRAFLUOR Plus 微孔板荧光仪探测荧光信号。这个实验方案可用于基础研究以及疾病的诊断分析。因此，该技术对于肿瘤生物学的研究以及基础和应用研究都有潜在的应用前景。

1. Nakagawara, A., Nathan, C.F., Cohn, Z.A. (1981) Hydrogen peroxide metabolism in human monocytes during differentiation in vitro. J. Clin. Invest . 68 , 1243-1251.

2. Rossi, F., Zabucchi, G., Dei, P., Bellavite, P., Berton, G. (1980) O 2- and H 2 O 2 production during respiratory burst in alveolar macrophages. In " Advances in Experimental Medicine and Biology ", (eds. Escobar M.E. and Friedman H.), Vol 121A, pp 53-74, Plenum Press, New York.