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膜的制备：
点杂交膜的制备有两种方法，一是将扩增产物直接固定于膜上，每 一个探针制备1张膜。然后，用不同的等位基因特异或某一微生物特 异探针在严格条件下杂交来检测扩增产物的突变类型或鉴定病原 菌；另一种方法是将不同的探针固定到尼龙膜上，然后，用标记的 PCR产物作探针去杂交。这样，根据杂交点的位置即可判断产物序列 变异的种类。显然，前一方法较后一方法繁琐，费时，费力；而后 一方法仅需一次杂交即可判断结果。
产物的固定：⑴取1张带正电荷的尼龙膜，按点样器的 大小裁剪膜，并做好标记。⑵将膜浸入水中湿透至少 1min。⑶变性PCR产物：此步可在圆底微孔板或微量离 心管内操作。每点的变性方法为；5～20μl(50～100ng)PCR 产物与100μl变性液（0.4mol/LNaOH-25mmol/LEDAT） 混匀，室温作用5min即可。⑷小心将预湿的膜装在点 样器上，注意膜与点样器接触表面不能有任何气泡。 因气泡会使点样点呈环形或月牙形或样品间弥散融 合。膜固定后，每孔内加100μl变性混合液，打开真 空泵。⑸抽干变性液后，每孔内再加100μlTE缓冲 液，真空抽滤“洗涤”样品。⑹取下膜，置于厚3mm滤 纸上渍干。重复制备用于其它基因探针的膜时，一定 要认真清洗点样器，以免样品间的交叉污染。⑺渍干 的膜于80℃真空干烤1h或于254nmUV光源下以60～120mJ/cm2 的强度下照射使DNA固定在膜上。此时，的膜可直接用 于杂交，也可以用滤纸包好存于塑料袋或干燥缸内。
探针的固定：因寡核苷酸的探针太短，在膜上固定较 困难，即使固定上，也会影响杂交。这就是需要将寡 核苷酸探针用末端转移酶加polydT尾后，UV线照射固 定。因为UV可激活胸腺嘧啶，使其与尼龙膜上的氨基 共价结合，使探针间接地牢固地固定在尼龙膜上。这 种加尾固定的探针不影响杂交。但这种杂交对固定探 针的要求是，在同一条件下与PCR产物的杂交必须是特 异的。通过选择探针的合适长度，G+C含量或通过改变 探针的固定可达到特异性的要求。这种固定的探针可 用于检测人类基因的突变，也可用来检测病原微生 物。
(1)加尾反应是用脱氧核糖核酸末端转移酶（TDT）催 化，它可将dT依次加在寡核苷酸的3’端，在四种脱氧 核苷中，以dT加尾效果最好。通过改变dT浓度和TdT量 可调节加尾长度，在下述反应条件下，加尾长度可达 400个dT。①向一微量离心管中依次加入：寡核苷酸探 针，100～200pmol;10×TdT缓冲液(1mol/L二甲胂酸钾; 250mmol/LTris-HCl，Ph7.6;10mmol/LCoCl2;2mmol/LDTT) 10μl;dTTP80～110nmol；TdT，60～80U；补水至100μl。 ②混匀后，稍加离心，置37℃水浴60～90min。③加入 100μl10mmol/LEDTA终止反应。加尾长度可通过10%聚 丙烯酰胺凝胶电泳监测。
(2)点膜：①加尾探针6pmol，用0.3mol/LNaOH室温处 理5min，然后，用2.5mol/LNH4Oac中和。②加入等体 积6×SSC(1×SSC:0.15mol/LNaCl，0.015mol/L柠檬酸三 钠pH7.0)。③将6×SSC预湿的尼龙膜（zeta-probe）或 hybond-N固定在点样器上。④点样方法同上。
(3)固定：①小心取下膜，置于TE缓冲液饱和的4～6 滤纸上，DNA面朝上。②将滤纸和膜一起置于254nmUV 灯下照射固定，poly(dT)400尾的探针在40mJ/cm2r的 剂下固定效果最好。辐射剂与给定光源对给定面积的 能量释放率（辐照度）和辐照时间有关。一般对一个 固定光源而言，辐照剂量为：
辐照剂量（J/cm2）=辐照度（w/m2）×辐照时间(s)
其中，J为辐照能量单位；w为辐照通量单位。辐照度 与照射角度有关，与入射角度θ的余弦（cosθ）呈正 相关。③固定后，在100ml6×SSC-0.5%SDS液中于42～55℃ 漂洗30min左右。漂洗后可立即用于杂交，也可以在蒸 溜水中浸洗，晾干后室温保存。
探针的固定量与加尾长度均影响杂交结果。如用poly (dT)400尾的不同固定量的探针与等PCR产物（2.33fmol） 杂交，固定6pmol苷酸杂交；时，有29.2%的PCR产物与 1.1%的寡核而固定的探针杂600fmol时，仅有2.2%的产 物与0.8%交。用不同加尾长度的等量产物6pmol固定寡 核苷酸与（时，仅0.33%233fmol）杂交结果表明， poly(dT)300探针与产物杂交；而有1.3%的探针poly (dT)400时，则与产物杂交。因此，固定的探针加最好 在400个以dT尾上，固定量也至少6pmol。
杂交
寡核苷酸探针的杂交：每一寡核苷酸探针均有自己的杂交温度和漂 洗条件，主要取决于探针的Tm值。Tm值则受探针长度，G+C含量和杂 交液的盐渡影响。一般要由如下公式：Tm=4(G+C)+2(A+T)来计算Tm 值。在1mol/L盐浓时，杂交温度可比预测的寡核苷酸Tm值低5～20℃。 提高杂交温度和降低盐浓度可提高杂交的严格性。漂洗液一般不含 盐，漂洗温度比杂交温度低5℃。一旦确定了探针的杂交与漂洗条 件，可按下述方法进行杂交。⑴在（2×SSPE3.6mol/LNaCl：; 200mmol/LNaH2PO4;20mmol/LEDTA，Ph7.4）液中预湿点样膜。⑵置 膜于塑料封口袋中，并加入适量杂交液（SSPE，5×Denhardt液， 0.5%TritonX-100），封口。袋内不要有气泡。⑶置于水浴加热摇 动，在杂交温度下预杂交5min。⑷取出塑料袋，剪开一角。加入非 放射性标记物（如生物素-补骨脂素）标记的探针。每毫升杂交中加 入1pmol探针。封口后摇育20～60min。杂交时间不能太长，否则会 引起探针与膜的不可逆结合。⑸从袋中取出膜，室温下在漂洗液 （SSPE-0.1%TritonX-100）中洗1～2次。⑹漂洗温度下预热的漂洗 液在合适温度下洗10min。漂洗后的膜可用于显色检测。
反向点杂交：反向点杂交即扩增产物作为相中的探针与固定到膜上 的寡核苷酸杂交。如前述，这种杂交最基本的要求就是在同一条件 下，所有固定探针均与扩增产物特异杂较。为此，主要是认真选择 与设计寡核苷酸探针，使各探针在同一条件下Tm值相近。在同一杂 交特异。一旦确定了合适的杂交和漂洗条件，即可按上述基本程度 杂交。只是杂交探针（产物）在加入前应加热变性或用等体积的 400mmol/LNaOH-10mmol/LEDTA变性。杂交时间（2～4h）要长些。PCR 产物的标记可以用标记引物扩增或在扩增时掺入标记物。
杂交的检测
不同非放射性标记物的检测原则上基本相同。若为酶标探针则可直 接进行显色检测。下面以生物素标记物为例加以说明。
酶标亲和素的结合 ⑴漂洗后的膜在缓冲液A（PBS，100mmol/LNaCl，5%TritonX-100） 中与一定浓度的HRP-标记链霉亲和素在室温作用10min，并轻轻振 荡。⑵用缓冲液B（液A，1mol/L尿素，1%硫酸葡聚糖）在室温下漂 洗5min，并轻轻振荡，将膜上非特异吸附的HRP-链霉亲和素洗掉。
显色 不同酶标亲和素的显色条件与底物均不同，下面以HRP的显色加以说 明。
⑴将上述膜于缓冲液C（100mmol/L柠檬酸钠，pH5.0）中在室温下作 用5min，并轻轻振荡。
⑵在缓冲液D中室温下，轻轻振荡10min。此步应避强光。缓冲液D： 1份底物（TMB：2mg/ml，用无水乙醇配制）和19份缓冲液C。
⑶在缓冲液E中显色，该液应现用现配。应避强光。缓冲液E：2000 份缓冲液D和1份3%H2O2。显色时间取决于杂交体中含标记物的量； 一般为1～15min即可。杂交阳性呈深蓝紫色。
⑷当膜色（信/噪比）合适时，在液C中洗膜1h终止反应，在此过程 中应更换2～3次液体。
⑸杂交膜可拍照记录结果，也可封于缓冲液C避光条件下贮存。
膜的再利用 ⑴脱色：将膜置于0.18%Na2SO4液中即可脱掉膜上的颜色。 ⑵去杂交的探针：将膜置于水-0.5%SDS中，65℃加热1h。 ⑶这种处理的膜可再与另一种探针杂交。
问题与对策
信号弱：①点膜的产物少-增加点膜量；②杂交时探针浓度低-加大 探针浓度；③杂交漂洗过于严格-增加盐浓度或降低杂交温度；④TMB 液贮存时间过长（TMB液4℃可存2个月）-重新配制。
本底信号强：①杂交时探针浓度高-降低探针浓度；②杂交时间长- 缩短杂交时间；③杂交漂洗不严格-降低盐浓度和提高杂交温度；④ 显色时间长-缩短显色时间。
杂交膜的高本底着色：①同②；②在缓冲液C中洗膜时间短-延长漂 洗时间（过多的硫酸葡聚糖也能增加膜的本底着色；③同2④；④避 光不严格-显色过程中及显色后要确保杂交膜的避光。
阴性对照出现阳性信号：①点样混淆，即把阳性标本点于阴性对照 的位置，重复实验即可纠正；②PCR较物的残留污染，用新配的试剂 重复全部扩增反应。
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