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经典型的苯丙酮尿(Phenyketon uria简PKU)是由苯丙氨酸羟化酶(PAH)的遗传性 缺陷引起的一种先天性代谢病，其发病早在我国以为1/10000左右，杂合子频率为 1/50.
PKU的临床表现
PKU患儿由于苯丙氨酸羟化酶的缺乏或不是使苯丙氨酸在休丙大量堆识，并经旁 路代谢途径产生一系列的毒性代谢产物而该小儿产生一系列的明显中毒症状.患儿在 刚出生时，由于无苯丙氨酸的摄入因此无临表现.随着患儿的退食而连续出现智力进 行性下降，皮肤色素浅，肌张力高，惊厥发生，汗和尿中有特殊的臭味，最经生活不 能自理，智力严重障碍.
PKU的遗传学
PKU是一种常染色体隐性遗传病，患儿的父母为致病基因的携带者而患儿为纯合 子.引起PKU的基因的PAH，该基因位于12q22-24.2全长约90kb，包括13个外显子和12 个内含子.内切酶解分析显示PAH的完整cDNA其有8个限制性内切酶切点，形成10个 RFLP.在人群中这些RFLP可组成1536种单倍型.过去对PKU的诊断即用此连锁分析.另外 在PAH基因内含有数个VNTR和STR.外显子3'锁700bp处有-(TCTA)重复序列，外显子 133'端下游3kb内有-30bpVNTR，它们仍有食杂的遗传病多态现象，可用为连锁分析时 的标记.
PAH基因突变类型
PAH基因的突变常见的有两种类型即缺失和单碱基置换，在我国人群中，已检测的 PKU均因PAH基因的单碱基量换所致.目前在我国其检出了15种以上的点突变6见表，这 些点突变在我国南方和北方人群中的频率有的不同.因此在PKU的诊断中注意这种差别.
中国人已检出的PAH基因点突变
| 突变位点代号 |
所外的外显子 |
突变性质 |
| E56D |
2 |
G→T |
| R111X |
3 |
C→T |
| IVS4nt-1 |
4 |
G→A |
| F161S |
5 |
T→C |
| Y204C |
6 |
A→G |
| R243Q |
7 |
G→A |
| G247V |
7 |
G→T |
| L255V |
7 |
T→C |
| R261Q |
7 |
G→A |
| IVS7n＋2 |
7 |
G→T |
| W326X |
10 |
G→A |
| A345T |
10 |
G→A |
| Y356X |
11 |
G→A |
| R413P |
12 |
G→C |
| T418P |
12 |
A→C |
PAH基因点突变的PCR检测
(一)PCR-ASO斑点杂交
在我国人群中，目前所发现的PAH基因突变以点突变为主，因此可以此来合成相 应的突变型寡核苷酸探针.来检测PKU患者的点突变，ASO法是最为有效的点突变检测 技术.随着非同位素标记探针的出现及反向斑点杂交的应用，预记该方法的临床应用 将愈来愈广泛.下表训列即为利用PCR-ASO检测时所用的引物.
探针
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突变位置及 性质
|
扩增 区域
|
引物
|
扩增 片段
|
突变探针
|
| R111×(C→T) |
3 |
F5'GTTAGGTTTTCCT GTTCTGG3' |
300bp |
35'GAGCTTTCATGA GATAAGA3' |
| |
|
R5'CTTATGTTGCAA AATTCCTC3' |
|
35'GAGCTTTCACGA GATAAGA3' |
| Y204C(A→G) |
6 |
F5'CACAGGTTCTGG TCCCCGAC3' |
354bp |
65'TTGTACTCACAG CAAGCAT3' |
| |
|
R5'CTCTCCTCTCCT CAATCCTC3' |
|
65'ATGCTTGCTATGA GTACAA3' |
| R243Q(G→A) |
7 |
F5'CTCCTAGTGCCT CTGACTCA3' |
291bp |
705'TTCCGCCTCCAA CCTGT3' |
| |
|
R5'ACCAGCCAGCA AATGAACCC3' |
|
75'TTCCGCCTCCGAC CTGT3' |
| W326X(G→A) |
10 |
F5'CCCAGTCAAGG TGACACATA3' |
256bp |
105'ACAGTAAACTAG TAAAT3' |
| |
|
R5'ACAAATAGGGTT TCAACAAT3' |
|
105'ATTTACTGGTTTA CTGT3' |
| Y356X(C→A) |
11 |
F5'TGAGAGAAGGGG CACAAATG3' |
320bp |
115'CTACAGTAATGC TTATC3' |
| |
|
R5'GTAGACATTGAG TCCACTCT3' |
|
115'CTACAGTACTGC TTATC3' |
| R413P(G→C) |
12 |
F5'ATGCCACTGAGA ACTCTCTT3' |
245bp |
125'GGTCGTAGGGAA CTGAG3' |
| |
|
R5'AGTCTTCGATTA CTGAGAAA3' |
|
125'GGTCGTAGCGAA CTGAG3' |
扩增时所用引物系根据每个外显子两侧的旁侧序列的设计.扩增片段包括完整的 外显子区域其两侧部分内含子序列.
(二)3'-碱基特异PCR，高位特异PCR
在以PCR为主的已知突变检测中，3'BSPCR是最简便可行的一种检测技术.在应用 时，采用正常引物和突变引物两组试验，以确定何种引物可扩增，然后电泳确定有无相应的突变. 由个PAH各外显子间的距离较大，各自有独立的引物，因此可用多重PCR同时扩增数 个外显子.不应同时，可将正常引物编为一组，突变引物编为一组进行两组多渗PCR. 然后用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物以确定突变位点.
表所到即为国内报道的用等位特异PCR
诊断PKU后用的相物及扩增片段，检测位置
|
外显子 及位置
|
共同引物
|
正常引物
|
突变引物
|
C/N
|
C/M
|
| 3， R111× (C→T) (CGA→ TGA) |
C:5'TCTAGAC CTTCTCG-3' |
N:5'-TTCTTCT TATCTCG-3' |
M:5'-CTTTCTT CTTATCTCA-3' |
147 |
148 |
| 6， Y204 (A→G) (TAT→ TGT) |
C:5'-AGCCCA TCCCTCGA-3' |
N:5'-ATGTGAT TGTACTCAT-3' |
M:5'-AATGTGA TTGTACTCAC-3' |
114 |
113 |
| 7， R243Q (G→A) (CGA→ CAA) |
C:5'-CAGTAC TCACGGTTCG-3' |
N:5'-GTTTCCGC CTCCGA-3' |
M:5'-GGTTTCC GCCTCCA-3' |
138 |
137 |
| 11， Y356X (C→A) (TAC→ TAA) |
C:5'-TCTCTG CCACGTAA-3' |
N:5'-TGGGGCC TACAGTAC-3' |
M:5'-TGGGGCC TACAGTAA-3' |
118 |
118 |
| 12， R413P (G→C) (CGC→ CCC) |
C:5'-TACTGT TAATGGAATC-3' |
N:5'-CCCTTCTC AGTTCG-3' |
M:5'-CCCTTCT CAGTTCC-3' |
94 |
94 |
(三)用PCR直接检测发生点突变的内切酶点
在PKU已检出的突变位点中，有七个位点的突变改变了限制性内切酶的识别位点. 若用该酶切位点两侧的引物扩增包括内切酶识别位点在内的DNA的酶，然后将扩增产物用内切酶 溶解，通过琼脂糖凝胶电泳分离酶切点段，以判定个体有无该内切酶识别位点的突变，引起内切酶识别 位点改变的点突变见
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基因突变类型
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扩增区域
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内切酶
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识别位点
|
突变结果
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| F56(G→T) |
2
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MnⅠ |
CCT(N) |
消失 |
| R111×(T→T) |
3
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BspHⅠ |
TCATGA |
出现酶切位点 |
| |
NLaⅢ |
CATG |
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| IVS4n＋(C→A) |
5
|
MaeⅠ |
CTAG |
消失 |
| |
DneⅠ |
CTNAG |
新切点出现 |
| G247V(G→T) |
7
|
HaeⅢ |
GGCC |
消失 |
| W326×(G→A) |
10
|
DdeⅠ |
CTNAG |
出现新切点 |
| A345T(G→A) |
10
|
RsaⅠ |
GTAC |
出现新切点 |
| Y356×(C→A) |
11
|
RsaⅠ |
GAC |
消失 |
(四)新的突变位点的PCR筛查:
对于有患者，不够用上述的PCR方法检出其突变位点，则可用PCR-SSCP，PGGE、 CDGE及其它的突变位点筛查技术进行筛查，以确定检出的突弯位点与PKU的关系.
PKUPCR诊断的途径
(一)利用PCR-ASO检测，近年来又发展了反向点杂交及非同位标记探针，与PCR-A SO应用起来更为方便，它是检测PKU点突变的最为手段之一.
(二)利用等位特异PCR(ASPCR)
若将ASP-PCR与多重PCR结合，形成MASP-PCR则一见可检测多个突变位点，要是一 个非常有效的PKU诊断手段.
(三)利用PCR-RFLP诊断
由于某些突变涉及到酶切位点的变化，因此右PCR-RFLP进行诊断PKU.
PCR在PKU的产前诊断断中的应用
由于PKU的治目前沿无有效的方法，因此其产前诊断，防止PKU患儿的出生具有重 要的意义，在PKU的产前诊断中，RFLP是较为传统的诊断方法，操作费时，不能及时 提供临床诊断信息，而且有相当大的一部分不能提供信息加止还要用同位素标记的探 针进行操作，因而大大的限制了其原因，应用PCR技术诊断PKU快速准确，易于满足临 床需要，而是便于推广应用.
(一)，PCR-ASO
传统的PCR-ASO及类似的诊断方法尽管准确有效，但操作复杂，往往需要进行多 次操作，确诊一测颇为费时，近年来应用的反向点杂交法(reverse dot bolt RDD)， 改变了传统的点杂交程序，因而该其检测时程明显缩短，操作也较简化.RDB是将一系 列的ASO探针先固定于膜上，然后用扩增的靶DNA与之杂交，在应用时，可将一些较为 常见的点突变探针固定于同一膜，而少见的固定于同一膜，因此结束分析样品最多只 需杂产两次即可完成PKU的诊断，在这种情况下，即使无证者一亦可进行产前诊断.
(二)MASP.PCR
采用MASPPCR亦是进行已知PAU突变点基因产前诊断的简易方法之一.
(三)AmPFLP+PCR-SSCP快速诊断
尽管采用PCR-ASO和MASP-PCR可检测全部的常见的PAH基因的已知点突变，但它只 能诊断约70～80%的PKU患者及浸入，仍有相当一部分不能同上述方法进行产前诊断， 我国董尚志等人利用PAH是国内的STP及VNTR作为多态性标记结合PCR-SSCP进行产前诊 断，其诊断的准确率可达90%左右诊方法包括以下几步.
1.Amp-FLP连锁分布：等用PAH基因内含子中-STR多态性进行分析，可次66.2%的家之获得有用的诊断信 息，其引物序列为:可扩增片段大小范围为，扩增完毕合用变性胶(尿素)PAG电泳分析 扩增长产物的片段多态性和先证者及携带者对照，确定胎儿的基因组合，以判断是否 为PKU患儿，若用连锁分析不能诊断则进入下步
2.外显子4PCR-SSCP
3.外显子7，11，12SSCP分析：通过上述3步分析，诊断常可达90%以上，该方法简使快速，准确率多，极适合于 基础应用.若将PCR-ASORDB与Amp-FLP联合应用，则定确率定高，况且要进行杂交，条 件及探治相对复杂，因此尚不够广泛推广于临床检测.
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