HSVAg在临床标本的检测中，其方法学发展以快速、特异、敏感、稳定、方便及无损害性为原则，主要集中在ELISA、IFA、LA三方面研究与改进较多，而象RIA和免疫发光方法等应用较少.

　　1)，免疫酶方法(EIA)

　　1.基本原理:这是一种将抗体的特异性和酶的生物学放大作用有机结合在一起的特异而敏感的免疫学检测方法，酶可以直接标记在抗体或SPA上，也可以利用与抗酶抗体形成免疫复合物(Peroxidase-Anti-Peroxidase PAP).根据抗原抗体结合的严格特异性，用已知的抗体可以检测出未知的抗原.2.方法评估:由于免疫酶方法简便，不需要特殊仪器，所使用试剂对人体无害或危害较小，因而引近年来在HSV诊断上大受青睐.一般认为EIA的标本检出率在52.5～96.1%.3.研究与改进:

　　(1)抗原捕获.Cleveland(EIFT法，Enzyme Immuno filtration Technique和Zimmerman(MEIA法，Membrane Enzyme Immunoassay)分别用特制的滤膜来捕获临床标本中的感染细胞及游离HSVAg，快速并提高阳性检出率.

　　(2)特异性抗体.第四军医大学分子病毒室的双抗体夹心法由多克隆抗体改用单克隆抗体后，大大提高了特异性，同时采用多株单克隆抗体混合使用，还使EIA的敏感性提高，结果与国外报道一致.

　　(3)酶选择，目前主要用辣根过氧化物酶(HRP)和硷性磷酸酶(AKP).根据Clayton的试验结果，AKP较HRP敏感.

　　(4)底物选择.除常规用OPD外，Clayton改用TMB作底物(TMB-ELISA);Moss则用NADP作底物(AMP-ELISA)并与TMB-ELISA进行比较，发现敏感性NADP>TMB>OPD,另外还要根据实验要求而选用其它底物

　　(5)酶放大系统.用SPA标酶，由于SPA可以与不同动物的IgG结合，既可以快速、又增加了酶标物的广泛适用性;用抗过氧化物酶抗体与过氧化物酶形成免疫复合物(PAP法)，加入桥抗体连接检测系统，一方面克服了标记酶过程中对抗体和酶的生物学活性的影响作用，另一方面由于抗体的多级放大，较大地提高了敏感性，其敏感性甚至超过细胞培养;BAS(Biotin-Avidin System)是70年代用于免疫学检测的放大系统，由于亲和素与抗体偶联后，极大地提高了敏感性.Adler-Storthz用BA-ELISA(biotin-avidin-amplified enzyme-linked immunosorbent assay)检测灵敏度达90PFU(plaque forming unit)，但其稳定性较差;存在把亲和素(avidin)改用链亲和素(streptavidin)，用Biotin-Streptavidin构建的HERP CHEK ELISA检测HSV感染，使敏感性和特异性得到更大的提高，且稳定性好.

　　(6)存在问题.除了上述几个问题仍有待完善发展外，在快速和定量、检测自动化上仍有较多工作做.

　　2)免疫荧光法(IFA)

　　1.基本原理:在已知抗体上标记上荧光素，当抗原抗体特异性结合后，在荧光显微镜下，就可根据荧光来指示抗原抗体复合物的存在，从而检测病毒抗原.

　　2.方法评估:IFA操作简单，2～3h就可以出结果.特别是应用单克隆抗体后，特异性高，可用于临床诊断和病毒鉴定.但由于需要荧光显微镜，且结果带主观性，使普及应用受到一定限制.免疫荧光根据荧光素标记抗体情况可以分为直接法和间接法，直接法是荧光标记在第一抗体-即特异针对HSV抗体，直接法标记检出率10～82%;间接法是荧光素标记在第二抗体-即抗第一抗体的抗体，这种方法的优点除了增大了荧光抗体的应用谱外，还具有二级放大作用，从而提高了阳性率80～90%，但特异性下降.

　　3.研究与改进:(1)抗体选择.由于组织细胞中存在自然荧光，易出现非特异性结果.为了提高特异性，除了在方法学中作一些处理外，选用单克隆抗体无论是特异性上，还是分型上都较多克隆抗体好.(2)荧光素.利用不同荧光素发出不同荧光(phycoerythrin产生桔黄色荧光，FITC产生苹果绿色荧光)而分别标记在不同型特异性单克隆抗体上，可以在同一个标本中出现HSV-1和HSV-2的不同颜色荧光，从而直观地反应混合感染.(3)放大系统.可选用BA标记荧光素，BA-IFA可以提高敏感性.(4)存在问题.首先是IFA的敏感性有待提高，可以引进Biotin-Streptavidin系统;应解决目测定性的主观因素而向仪器自动化定量的客观指标方向发展;荧光显微镜的轻便小型化，以便适应基层单位和野外条件使用.

　　3)乳胶凝集试验(LA)

　　1.基本原理:将特异性的抗体与乳胶颗粒结合成复合物，当有HSVAg存在时，就会形成抗原-抗体-胶乳聚合物，出现肉眼可见的凝集.

　　2.方法评估:该方法的突出优点是快速，一般可在半小时出结果，不需要特殊仪器，适用于大批标本的筛检，但其敏感性差，约50%检出率，当与组织培养比较时，只有当CRE>10%，LA方能更好检出.

　　3.研究与改进:(1)增强凝集条件.试验过程中，加入一种样本吸收剂，并通过离心来增强乳胶凝集效果.(2)存在问题.主要是敏感性较差.同时应注重单克隆抗体在乳胶凝集中的应用.

　　1.基本原理:主要是利用四种脱氧核苷酸中硷基的配对性原则(G=C、A=T)建立的一种检测方法，选定病毒DNA某段序列合成或克隆互补性探针序列，标记上同位素或生物素，当样本中存在该段序列时，就会出现阳性结果.

　　2.方法评估:DNA探针作为一种HSV检测手段具有先进性和准确性，可检出1PgDNA、2～8个感染细胞或10个PFU.与细胞培养相比，其特异性为63～100%，敏感性为25.4～92%.但该方法要求试验条件高、费时费事，且标记同位素不仅有损害性，还不易保存，作常规检测受到限制.

　　3.研究与改进:(1)探针制备.一般探针长度在20～30个硷基，越长特异性越好.常用HSVDNA探针大多数从重组质粒如pRC101、pRC102、pBR222中用核酸内切酶切下已知DNA探针;也可以通过PCR方法扩增制备;目前最多是通过核酸自动合成仪进行合成.

　　(2)标记物.可以标记同位素3H或32P，H的半衰期长，因而结果重复性和标记探针贮存较好，但结果慢;P半衰期短，标记探针贮存较困难，但结果快，二者对人均有损害性，现在已有改用无放射性的生物素标记探针.

　　(3)分型.目前有分型和不分型二种探针，一般讲分型在病因学和流行病学上更有意义.

　　(4)存在问题.除了要进一步提高特异性和敏感性外，还要解决快速、早期诊断、降低试验成本和简化试验条件.

　　所有用于检测抗原的免疫学方法经适当改良后，均可用于抗体的检测，如IFA、ELISA、RIA、LA......由于抗原方法的敏感性提高和PCR技术的应用，使得HSV抗体在HSV感染个体中的不均一性和不稳定性影响了这类指标在临床诊断中的意义，但作为一种感染有关指标，在一定的范围和情况下，仍有必要进行检测和深入研究.目前HSV特异性抗体的检测，主要有IgG、IgM和IgA三种.

　　1.IgG抗体:HSV-IgG主要用于HSE诊断中，单份血清中IgG抗体水平表示自然免疫状况，在我国HSV-IgG阳性率达90%以上，只有在特定部位如CSF中>1∶80、或神经鞘内HSV-IgG阳性才有提示感染的意义;双份血清中IgG抗体滴度有4倍以上升提高者、或血/CSF值在20～40∶1，才能诊断HSV近期感染;有些研究者对抗体HSV结构蛋白的特异性抗体进行了探计，结论不一，还有待进一步研究.IgG抗体在ELISA检测时可以跟IgM同步出现或稍后几天.

　　2.IgM抗体:HSV-IgM作为HSV感染指标，特别是脑部感染具有一定的临床积极意义.HSV-IgM出现在临床症状发作后第3天直到4周，初次感染者100%阳性、再次感染者48%阳性，虽然IgM抗体常作为许多传染病的早期诊断指标、但在HSV感染中，由于HSV反复感染均可引起IgM出现，影响了作为初次早期诊断的意义.HSV-IgM在CSF中的检测结果仍有争议，有的结果发现成人HSE的CSF中IgM滴度比血清中更高;有的则只有新生儿脑炎CSF中发现IgM抗体存在，成人脑炎CSF中未发现;但有的在HSE和急性硬化性全脑炎的CSF中未发现IgM抗体.一般认为IgM抗体不能通过血脑屏障，在CSF中检测HSV-IgM对HSE具有诊断价值.

　　3.IgA抗体:HSV-IgA是一种与局部免疫有关的抗体.SIgA可在HSK初次症状出现后第3～5天的泪液中达到高峰;在女性生殖道疱疹病毒感染的血清中，初次感染者以11SHSV-IgA为主，再次感染则以7S为主.单纯以ELISA检测血清中HSV-IgA出现，在初次感染者中阳性率为72.4%，再次感染阳性率为81%，所以从血清中检测HSV-IgA来确诊HSV初次感染是不可能的，但检测分泌物中SIgA作为局部感染的间接诊断指标和免疫指标仍有待进一步研究.

检测HSV PCR方法应用的评价

　　1.基本原理:选择病毒某段特定基因序列(一般多为保守序列)设计引物，由于引物与病毒该段基因存在着特异的互补性，当加入DNA聚合酶后，就会在引物的引导下合成该段段，序列片通过人为条件扩增放大后，就可以在电泳胶经溴乙淀染色，根据片段大小来判段标本中某种病毒的存在.

　　2.方法评估:PCR作为一种新型诊断方法，特别是它的灵敏度高，可检测到小致3个PFU，PCR的敏感性较细胞培养高，已初步在临床病毒检验工作中显示出了较大的优越性.但该方法由于高灵敏度，易产生污染而导致假阳性，且需要特殊的仪器和进口试剂，在普及推广中目前有困难.

　　3.研究与改进:(1)DNA诊断区的选择.目前均选择高保守序列区.主要集中在DNA聚合酶基因区、胸腺嘧啶核苷激酶(TK)基因区、糖蛋白D基因区.

　　(2)引物设计.引物的大小在20～28个寡核苷酸，引物的数量有2个、3个、4个不等.

　　(3)与酶谱结合诊断.Rozenberg和Lebon选用HSVDNA聚合酶基因高保守区设计一对引物，可以扩增出HSV-1、HSV-2、CMV、EBV的DNA聚合酶基因片段，根据扩增产物片段的大小再结合SmaI和BamHI二种酶对不同扩增产物片段的酶切谱的不同进行分型、诊断.

　　(4)与Southen印迹法结合.Klapper等选用HSVTK基因保守区设计了一对引物，与生物素化的TK基因探针联合诊断、提高特异性.

　　(5)分型.在诊断HSV的基础上，不光试图对HSV-1、HSV-2、进行分型，并希望在一个方法中能把更多的相关病毒区分开如HSV-1、HSV-2、CMV、EBV.

　　(6)存在问题.对污染的DNA清除与破坏，克服PCR假阳性是一大难题;解决进口试剂等、降低试验成本将有利于PCR的普及.

应用PCR技术进一步研究HSV的课题及方向

　　PCR技术不但在HSV感染检测中具有重要的应用价值，而且在HSV分子生物学和HSV基因重组株构建及HSV的基因表达等课题研究中具有广泛的应用. 共3页: 上一页 [1] 2 [3] 下一页