一、准备100ml玻璃瓶12只,橡皮头12只。
反复刷洗、置于鼓风干燥箱干燥、泡酸、自来水冲洗6遍、自来水流水过液、蒸馏水过3遍、置于鼓风干燥箱干燥,包装:纸+2层沙布将瓶口扎紧。包装后高压消毒备用。橡皮头:12只,独立包装。
二、配培养液(配制1升粉末培养基为例)
1、5%NaHCO3与2N HCl配制:①5%NaHCO3:取5g NaHCO3加双蒸水至100ml,即为5%NaHCO3。②2N HCl:取浓HCl 16.7ml加双蒸水至100ml,即为2N HCl。用于调节培养液pH,pH为7.2-7.4。强酸(HCl)氯离子对细胞生长可能有影响,且贮存时培养基的pH易发生改变。
2、其他材料:新鲜制备超纯水(阻抗值>18 MΩ)或三蒸水1000ml(2小时左右);粉末培养基;NaHCO3(Sigma S-4019);电磁搅拌器;无菌血清瓶;0.1或0.2mm无菌过滤膜;pH meter;真空帮浦。滴管2根、1000ml量筒、1000ml烧杯、100ml烧杯、20ml注射器、青链霉素、PH试纸。酒精灯、镊子、试管架、75%酒精棉球、污物杯、抽滤器配套杯一个。滤纸-滤膜-滤纸-滤膜-滤纸
3、步骤:①取粉末培养基溶于超纯水中,搅拌使其溶解。②用5%NaHCO3与2N HCl调节pH。培养基以真空帮浦通过过滤膜时,pH会升高0.1-0.2。③以0.22mm无菌过滤膜过滤灭菌,同时分装至无菌容器中,标示培养基种类、日期、瓶号等,贮存于4℃。⑤配制之培养基配制须作生长试验与污染测试。
三、保存
1、液体培养基贮存于4℃冰箱或-20℃,避免光照,实验进行前放在37℃水槽中温热。
2、液体培养基(加血清)存放期为六个月,期间glutamine可能会分解,若细胞生长不佳,可以再添加适量glutamine。
四、缓冲液配制
GNB10010 PBS缓冲液:每升含 KH2PO4 0.144g, NaCl 9.0g, Na2HPO47H2O 0.795g。pH7.4。15-30℃保存。
GNB20012 PBS缓冲液:每升含 KH2PO4 0.210g, NaCl 9.0g, Na2HPO47H2O 0.726g。pH7.4。15-30℃保存。
GNB14190 D-PBS缓冲液:不含Ca, Mg, 碳酸氢钠。15-30℃保存。无机盐(g/L):KCl0.20;KH2PO40.20;NaCl8.00 Na2HPO4·7H2O2.16