1）      用酸性酚-硫氰酸胍-氯仿提取纯化组织和细胞中的RNA

1.      选取从组织细胞或细胞中提取RNA的适宜方法

组织

a.       分离组织并立即置于液氮中。

b.      将约100 mg冰冻组织含液氮的研钵中，用研棒研磨。研磨过程中可加入液氮使组织保持冰冻状态。

c.       将组织碎末移入含3 ml溶液D的管中。

D溶液（变性液）

4 mol/L 硫氰酸胍

25 mmol/L 柠檬酸钠?2H₂O

0.5%（m/V）月桂基磺酸钠

0.1  mol/L β-巯基乙醇

将250 g硫氰酸胍、0.75 mol/L（pH 7.0）柠檬酸钠17.6 ml和26.4 mol 10% (m/V) 月桂基磺酸钠于293 ml水中。加入搅拌子于磁力搅拌器上65℃混匀，直至完全溶解。室温贮存溶液D，每次临用前加入14.4 mol/L的β-巯基乙醇，每50 ml溶液D加0.36 ml。溶液D可在室温下避光保存数月。注意胍基盐在低温下易沉淀。

d.      用搅拌子室温下搅拌组织15~30s。

哺乳动物悬浮细胞

a.       室温下200~1900 g离心5~10 min（1000~3000 r/min用Sorvall RT600, H1000转子）收获细胞。

b.      吸出培养基将细胞重悬于1~2 ml冰预冷的PBS中。

c.       离心收获细胞，彻底吸尽PBS，每10⁶细胞加2 ml溶液D。

d.      用搅拌子室温下搅拌细胞15~30 s。

哺乳动物单层培养细胞

a.       吸出培养基用5~10 ml冰冷的PBS洗细胞一次。

b.      吸出PBS加入溶液D覆盖细胞，90 mm培养皿加2 ml（60 mm培养皿加1 ml）。

c.       将细胞溶解物移至管中。

d.      用搅拌子室温下搅拌溶解细胞15~30 s。

2.      将混合物移至一管中，在每毫升溶液D中立即加入0.1 ml 2 mol/L的醋酸钠（pH 4.0），1 ml酚，0.2 ml氯仿-异戊醇。加入每组组分后，盖上管盖，倒置混匀。

3.      将匀浆剧烈振荡10 s。冰浴15 min使核蛋白质复合体彻底裂解。

4.      10 000 g（9000 r/min用Sorvall SS-34转子）4℃离心20 min，将上层含RNA的水相移入一新管中。

5.      加入于提取的RNA等量的异丙醇。充分混合液体，并在-20℃沉淀RNA 1h或更长时间。

6.      10 000g (9000 r/min用Sorvall SS-34转子)4℃离心30 min，收集沉淀的RNA。

7.      轻轻倒出异丙醇加入溶液D溶解RNA颗粒，每1 ml第一步所使用的溶液加0.3 ml溶液D。

8.      将溶液移至一微量离心管，涡旋混匀，并在-20℃用等量异丙醇沉淀RNA 1h或更长时间。

9.      在微量离心机上，于4℃最大速离心10 min收集RNA沉淀。用75%的乙醇洗涤沉淀2次，重复离心。用一次性使用的吸头吸出残存的乙醇。将打开盖的离心管在实验台放置几分钟，以便乙醇蒸发。RNA不可完全干燥。

10.  加50～100μl DEPC处理过的水。将RNA溶液贮存于-70℃。

11.  估计RNA的浓度。

2）      根据大小分离RNA：乙二醛化RNA的琼脂凝胶电泳

1. 配制乙二醛变性反应液。在无菌离心管中混合：

   RNA（总共10μg）     1～2 μl

   乙二醛反应混合液         10 μl

2. 盖上离心管的盖子，将RNA溶液在55℃放置60 min，在冰水中冰浴10 min，然后离心5 s，使所有液体沉到离心管底部。

3. 在样品加热过程中，将琼脂凝胶装到水平电泳仪的盒子中。加入足够的1×BPTE电泳缓冲液，使其没过凝胶约1 mmol/L。

4. 将1～2μl RNA上样缓冲液加到乙二醛化的RNA样品中，然后马上把RNA样品加到凝胶加样孔中，留着两边最外面的两个孔不要加样。将RNA相对分子质量标准参照物加到最外面的孔中。

5. 以5 V/cm的电压进行电泳，直到溴酚蓝迁移大约8cm。

6. 将凝胶放在保鲜膜上，在紫外灯下观察RNA。把透明尺和凝胶对齐，在紫外灯下拍照。

7. 在照片上量出从加样孔到各RNA条带的距离。 以RNA片段大小的对数（log₁₀）值对迁移的距离作图。用得到的曲线计算点杂交检测到的RNA的大小。

8．用上行或下行毛细管转移法把RNA固定在固体支持物上。