聚丙酰胺凝胶电泳

中性聚丙烯酰胺凝胶电泳

安装电泳装置和配制凝胶溶液

1.      必要时可用KOH/甲醇清洗玻璃板和间隔片。

2.      用温热的去污剂溶液洗涤玻璃板和间隔片，再充分漂洗，先用自来水，再用去离子水。应拿取玻璃的边缘部分或带手套操作，以免手上的油脂残留在玻璃板的工作面上。用乙醇冲洗玻璃板，并将其置于一边晾干。

3.      （可做可不做）其中一块玻璃板的一面用硅化液处理（如Sigmacote或Acrylease）：在化学通风厨内，将玻璃板放于一叠纸巾上，倒少量硅化液于其表面上，用Kimwipes纸巾涂抹均匀，然后用去离子水冲洗、纸巾擦干。

4.      安装玻璃与间隔片：

a.       将较大的（不带凹口）玻璃板平放在实验台上，在玻璃板的两侧将间隔片平行置于其边缘放妥。

b.      用凡士林轻涂以助于间隔片在后面的操作中保持原位。

c.       将内板（带凹口的玻璃板）在间隔片上放妥。

d.      用夹子或铁皮制纸夹将玻璃板加在一起，将整块玻璃的两边及底部用凝胶密封带封紧，形成不透水密封。

5.      根据玻璃板的大小和间隔片的厚度计算所需凝胶的体积。

6.      （可做可不做）将所需用量的聚丙烯酰胺：亚甲双丙烯酰溶液放于一干净的带侧臂的烧瓶中，加入磁力搅拌子，抽真空脱气。开始脱气应温和一些，并边脱气边旋转烧瓶直至不再有气泡溢出为止。

 

灌制凝胶

7.      下面的操作需要戴手套，在托盘上进行，以免溅出的丙烯酰胺：亚甲双丙烯酰溶液洒在实验台上。动作应迅速，于丙烯酰胺聚合前完成。

a.       每100ml丙烯酰胺：亚甲双丙烯酰溶液中加入35μl TEMED，轻轻旋转混匀溶液。

b.      用50ml注射器吸取凝胶溶液，调转注射器，排净进入针管的空气。将注射器的针头插入两块玻璃板之间的空隙，注入丙烯酰胺溶液，几乎注满改空隙。

c.       将玻璃板斜靠在试管架上，与实验台面成约10°角。

8.      立即将合适的梳子插到凝胶中，小心勿使梳齿下留有泡。梳子的顶端应略高于玻璃板的上沿。用铁皮制纸夹将梳子夹紧，使其就位。必要时，用剩余的丙烯酰胺溶液完全充满模具。确认无丙烯酰胺溶液从模具漏出。

9.      丙烯酰胺于室温聚合30~60min。若凝胶回缩明显，应补加丙烯酰胺：亚甲双丙烯酰溶液。

10.  聚合完全后，用1×TBE浸润的纸巾包绕梳子和凝胶的顶部。然后用Saran Wrap模密封整块凝胶，4℃保存，直至使用。

11.  当准备好进行电泳时，在梳子的周围及其顶部喷些1×TBE缓冲液，从聚合的凝胶中小心取出梳子。用注射器吸取1×TBE冲洗加样孔。用剃须刀或解剖刀除去凝胶底部的密封胶带。

 

上样与电泳

12.  将凝胶放入电泳槽中，用大号铁皮制夹子夹住其边缘或用装置本身的夹子固定。带凹口的玻璃板应面对缓冲液槽向里面放置。

13.  用配制凝胶溶液同一批次的5×TBE配制电泳缓冲液灌满缓冲液槽。用一根弯头巴斯德吸管或注射针头排除藏匿于凝胶底部的气泡。

14.  用巴斯德吸管或注射器再次吸取1×TBE冲洗加样孔。将DNA样品与适量6×凝胶载样缓冲液混合，用Hamilton注射器或带有拉长的塑料吸头的微量移液管加入加样孔。

15.  将电极与电源相连（正极接下槽），打开电源，进行电泳。

16.  电泳至标准参照染料迁移至所需位置。关闭电源，拔掉插头，弃去电泳槽中的电泳缓冲液。

17.  卸下玻璃板，用解剖刀或剃须刀片除去凝胶密封胶带。将玻璃板放在实验台上（硅化的玻璃板在上面）。用间隔片或塑料楔将上面的玻璃板的一角翘起。检查一下凝胶仍应附着在下面玻璃板上。将上面的玻璃板平稳的移开，去掉间隔片。

18.  用染色检测或放射自显影检测检测聚丙烯酰胺凝胶中的DNA条带的位置。