确定各种可能与目标蛋白相互作用的蛋白质，“撒大网”

l        双杂交和其他双成分系统

第一阶段：诱饵-LexA融合蛋白的鉴定

诱饵-LexA融合蛋白的构建

1．将编码诱饵蛋白的靶DNA克隆到LexA融合载体的多聚接头处，以合成一种框架内的LexA融合基因。确定诱饵序列的羧基端存在翻译终止序列。形成的质粒作为pBait。

2．采用下列LexA融合基因和lexAop-lacZ报道质粒的组合，建立一系列EGY48 lexAop-LEU2选择的转化酵母菌：

a.       pBait + pMW12（活化测定）

b.       pSH17-4 + pMW12（活化的阳性对照）

c.       pRFHM1 + pMW12（活化的阴性对照）

d.       pBait + pJK101（抑制/DNA结合测定）

e.       pRFHM1 + pJK101（抑制的阳性对照）

f.        pJK101单独（抑制的阴性对照）

3．将每种转化混合物铺在适宜的选择性缺陷板上：CM(Glu)-Ura-His（针对质粒组合a~e）或CM(Glu)-Ura（针对质粒组合f）。将培养板在37℃培养2~3天以选择含有质粒的转化酵母克隆。

4．制备转化子的母板。

活化和抑制活性的鉴定：X-gal和Leu2表型的分析

5．从a~f

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