RNA点杂交

1）  纯化的RNA的点杂交和狭线杂交

安装印迹装置

1．切一张合适大小的带正电荷尼龙膜。用铅笔标上表示方向的记号。用水把膜简单弄湿，在20×SSC中室温泡1 h。

2．在膜浸泡期间，先用0.1 mol/L NaOH小心清洗印迹装置，再用无菌水洗干净。

3．把两片厚滤纸用20×SSC浸湿，再放到真空器顶部。

4．把样品槽插入装置的上部，把湿尼龙膜放在样品槽加样孔的底部，用吸管在膜的表面滚动以去除膜与装置夹层中的气泡。

5．加紧夹板，连接真空管。

6．加入10×SSC直至液面没过尼龙膜，关掉真空，再用10×SSC充满。

 

RNA样品准备

1．把每个RNA样品（溶解在10μl水）分别与30μl RNA变性液混合。

2．65℃温育5 min，然后在冰上冷却。

3．向每个样品中加入等体积20×SSC。

4．轻轻向印迹装置中吸入10×SSC，直到淹没尼龙膜。

 

RNA样品的印迹和RNA在膜上的固定

1．把所有样品轻轻加入狭线中，然后轻轻吸干膜。当所有样品都铺到膜上后，每个狭线用1 ml 10×SSC洗两次。

2．当第二次洗膜完成后，继续轻轻吸干膜。

3．取下膜，用紫外交联、烘烤或微波照射把RNA固定在膜上。

 

固定化RNA的杂交与洗膜

1．把膜放入烤盘或杂交炉中，加入10~20 ml预杂交液68℃温育2 h。

2．把已变性的放射性标记的探针直接加到预杂交液中。在适当的温度下继续温育12～16 h。

3．杂交完后从塑料袋中取出膜，然后尽可能快地把膜转移到室温下装有100～200 ml、1×SSC（0.1% SDS）的塑料容器中。盖紧塑料容器，放到摇床上轻摇10 min。

4．把膜转移到另一个装有100～200 ml、预热到68℃的0.5×SSC（含0.1% SDS）的塑料袋中，然后在此温度下轻摇10 min。

5．按步骤17重复洗膜两次，使总的洗膜次数达到三次。

6．用滤纸吸干膜，在-70℃条件下放射自显影24～48 h（Kodak XAR-5 或相当的胶片）。钨酸盐型的增感屏比旧式稀土型的效果更好。当然，磷光成像仪也可以用来成像。

 

2）RNA斑点印迹的制备（详见《分子医学技术》106页）

1．裁一张大小合适的滤膜，用软铅笔标记RNA加样的位置，一个cm的方格即可。

2．以20×SSC浸泡滤膜。

3．在65℃用以下溶液温育5min，使10～20μg的总RNA变性。

总RNA（10～20μg）	2.0μl
变性液	6.0μl

    置冰浴快速冷却5min，用微量离心管离心片刻以回收液滴，将管置于冰浴。

4．将滤膜铺在一叠经20×SSC浸泡过的滤纸（如Whatman 3MM）上。

5．在膜上点样，每孔4μl RNA，待一孔干燥后再加另一孔。

6．将滤膜置滤纸（3MM）上稍微晾干，用20×SSC漂洗片刻。

7．当滤膜仍潮湿时，将滤膜RNA面朝下在紫外线透照仪照射3～5min，使RNA固定于滤膜上，此滤膜已可用于杂交。