RNA印迹杂交

1）       Northern印迹的制备

预备：

1．按下述步骤，每泳道加10～20μg总RNA或0.5～1μg poly(A)⁺RNA进行甲醛/琼脂糖凝胶电泳，将凝胶放在紫外线透照仪上，旁边置一标尺进行拍照。

a. 总RNA（10～20μg）用下列溶液在65℃温育5min：

总RNA（10～20μg）	6.0μl
甲酰胺	12.5μl
10×MOPS缓冲液	2.5μl
甲醛溶液（37％）	4.0μl

b. 置冰浴迅速冷却，加2.5μl上样缓冲液，并加样于按如下配制的甲醛/琼脂糖凝胶中。

琼脂糖	1.0g
10×MOPS缓冲液	10.0ml
H2O	73.0ml

c. 加热至100℃溶解凝胶，然后置50℃水浴箱降温。加17ml甲醛，混匀并立即倒胶。须在通风橱内带手套操作，用一电泳槽专供RNA电泳。

 

Northern印迹

1．当凝胶仍在电泳时，裁一张与凝胶大小相同的滤纸，以20×SSC浸泡。

2．安装转移装置，盘内倒入杂交缓冲液（20×SSC）。在缓冲液平面上做一平台，将凝胶盘倒置，并盖三张经20×SSC饱和的滤纸（Whatman 3MM），平台两端的滤纸应浸入缓冲液中，用10ml的玻璃吸管滚动以赶除气泡并将滤纸推平。

3．在滤纸表面倒入数ml 20×SSC，将凝胶倒扣于滤纸上，小心赶除凝胶与滤纸间的气泡，凝胶四周用胶布粘贴或用塑料薄膜包裹以防缓冲液直接从凝胶周围流至纸中（虹吸短路）。

4．用数ml 20×SSC浸没凝胶，置滤膜于凝胶上，确保凝胶与滤膜之间无气泡。用软铅笔标记面对凝胶的滤膜面。

5．滤膜表面放三张大小与滤膜相似并预先用20×SSC浸泡的3MM滤纸。

6．放一叠干燥吸水纸（印迹纸或纸巾）在3MM滤纸表面（约5～8cm高）。

7．在折叠纸上放一玻璃板，并在玻璃板上置0.75～1kg重的物体。

8．转移进行12～16小时，确保槽内有足够的20×SSC（约3L）。

9．转印后，小心拆卸印迹装置，将凝胶与滤膜一起转移到干燥滤纸上，凝胶在上。用软铅笔标记凝胶和滤膜加样孔的位置，撕去凝胶。

10．  以20×SSC漂洗滤膜片刻以去除琼脂糖残迹。

11．  将滤膜放在一块干燥的3MM滤纸上稍微晾干。

12．  固定RNA于滤膜上，将尼龙膜RNA面朝下在紫外透照仪照射3～5min。

13．  此滤膜可用于杂交或4℃保存，尼龙膜需要塑料袋密封。

 

2）RNA印迹杂交

1．用5×SSPE浸湿RNA滤膜。

2．将浸湿的RNA滤膜转移至塑料袋中，塑料袋四周封口并剪去一角。

3．预热预杂交液至42℃，经塑料袋开口处加入0.1ml/cm²的预热的预杂交液，小心移取，避免加入气泡，从塑料袋中挤压出所有气泡，密封塑料袋。

4．在42℃水浴摇床中温育塑料袋2～4小时，或将塑料袋夹于两块玻璃板中置42℃烤箱2～4h，确保滤膜表面无气泡。

5．置95℃ 10min使探针变性，立即置冰浴冷却5min。

6．剪去杂交袋一角，将预杂交液倒入15或50ml的Falcon试管中，加入约10～20ng/ml（随机引物标记）探针，一般来说，10⁶～10⁷cpm/ml已足够，轻轻混匀。用一次性塑料移液管将杂交液加入装有滤膜的塑料袋中。

7．从塑料袋的开口处将气泡全部压出，用纸巾揩去流出的少许杂交液，小心封好袋口，避免液体漏出。必要的话，可将塑料袋套入另一个塑料袋内以防放射性污染。

8．在42℃水浴摇床中温育12～16h，或夹在两块玻璃板中置42℃烤箱温育12～16h。

9．杂交完毕，打开塑料袋的一角，将杂交液倒入15或50ml的Falcon试管中。小心不要使放射性溶液溅出。

10．  将塑料袋完全打开，用钝头镊子将滤膜转移至盘中以便清洗，立即用缓冲液（2×SSC，0.1％SDS）1漂洗滤膜。

11．  室温下，用漂洗缓冲液1漂洗三次，每次5min。

12．  室温下，用漂洗缓冲液2（0.25×SSC，0.1％SDS）漂洗两次，每次5min。

13．  用预热45℃的漂洗缓冲液2漂洗1～3次，每次15min。在更换缓冲液之间，应用盖革计数器检测滞留在印迹中心的放射性。

14．  充分漂洗后，把杂交膜放在一张3MM滤纸上稍晾干后，将潮湿的滤膜封在塑料袋内或用塑料薄膜包裹。

15．  滤膜放射自显影：将杂交膜（包裹在塑料袋内，RNA面朝上）放在X射线暗盒底部，胶片放在其上。为方便起见，可将增感屏固定在暗盒盖上，关闭暗盒，在－70℃曝光1天～2周。

16．  将暗盒从冰箱内移出时，应有足够的时间（30min～1h）使其温度调至平衡。在暗室将胶片从暗盒取出，并在自动X线底片处理仪上冲洗。

 

3）从杂交膜上除去探针

1．煮沸0.1％SDS溶液。

2．把膜放在玻璃盘内，将溶液倒在膜上，凉至室温。

3．用盖革计数器检测降低的活性。