核糖核酸探针

1．室温下，于1.5ml无菌微量离心管内依次加入：

5μl               5×转录缓冲液

1μg               模板DNA

1.2μl             10 mmol/L rATP（终浓度为480μmol/L）

1.2μl             10 mmol/L rCTP（终浓度为480μmol/L）

1.2μl             10 mmol/L rGTP（终浓度为480μmol/L）

1μl               1 mmol/L UTP（终浓度为40μmol/L）

1μl               0.75 mol/L 二硫苏糖醇

1μl               RNase Block Ⅱ或0.5μl RNasin

5μl               α-[³²P]UTP（2.5μmol/L终浓度，DEPC水加至25μl）

1μl               T3, T7或SP6 RNA聚合酶（10U）

2．37～40℃温育60min。

3．若不做凝胶纯化步骤，则：

a.       加入1μl无核糖核酸酶的脱氧核糖核酸酶并在37℃温育15min。

b.      加DEPC处理水将体积增至100μl。加100μl苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）溶液再提取一次。

c.       再加入100μl氯仿：异戊醇（24：1）溶液再提取一次。

d.      加0.5倍体积7.5mol/L乙酸铵及2倍体积乙醇，置干冰中30min。

e.       10 000×g离心至少5 min（去除上清液并用盖革计数器监控）。

f.        用100μl 1mol/L乙酸铵重悬沉淀小团，重复d～e步骤。

g.       真空（真空旋转蒸发/浓缩仪）干燥沉淀小团，用DEPC水重悬沉淀小团，取1μl置液闪仪计数。

4．若需做凝胶纯化，则：

a.       将无RQ1 RNA酶的DNA酶处理步骤省去。

b.      制备测序凝胶（5％聚丙烯酰胺/6mol/L 尿素）

c.       加DEPC水将核糖核酸探针溶液体积增加至100μl，100μl苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）溶液提取一次，100μl氯仿：异戊醇（24：1）再提取一次。

d.      加0.5倍体积7.5mol/L乙酸铵，加2倍体积乙醇置干冰30分钟。

e.       10 000×g离心至少5min（去除上清液，并用盖革计数仪监控），真空干燥，用5μl DEPC水重悬沉淀。

f.        加10μl上样缓冲液，全部的样品上样电泳（样品上样前加热到85℃ 5min即置入冰中），在60W条件下至少电泳1.5h。

g.       去除玻璃板，用塑料薄膜包裹凝胶，X射线胶片曝光30～60s，核糖核酸探针所处位置呈现自显影像，用剃须刀准确切下相应凝胶条带。

h.       凝胶条用400μl洗脱缓冲液，37℃下，连续振荡洗脱4h。洗脱液移入干净离心管，盖革计数器检测洗脱液及凝胶条块（洗脱液中计数值应高于凝胶条）。

i.         加1μl冰冷乙醇并静置冰浴15min。

j.        10 000×g离心15min，乙醇沉淀。RNA沉淀用DEPC水再溶解，取1μl置液闪仪计数。