差减cDNA文库法

[第一条链cDNA合成]

1．合成第一条cDNA链时，所有试剂应按下列顺序依次加入：

10×第一条链合成缓冲液                 5.0μl

10mM dNTP Mix(1.4μg/μl)               2.5μl(终浓度1.25mM)

Linker primer(1.4μl，终浓度100μg/μl)

DEPc H₂O

RNase block Ⅱ(1U/μl)                   1.0

mRNA                                 1~5μg

混合，离心20秒钟，室温放置10分钟

2．加入逆转录酶至1500U/ml，补水到终体积50μl。

3．混合，取出5μl放入含有0.5μg α-³²P dATP（800Ci/mM），分别保温在37℃ 1小时。

4．保温后，带有同位素的离心管放入-20℃保存，为以后分析用。第一条链cDNA混合物放在冰上。

[第二条cDNA链的合成]

1．对于总体积为45μl的第一条链混合物按下列次序依次加入：

第一条链混合物                    45.0μl

10×第二条链缓冲液                20.0μl

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