调节瞬时转染基因的表达

l      四环素作为哺乳动物细胞中可诱导基因表达的调控物

阶段一：pTet-tTAk稳定转染成纤维细胞

培养和转染细胞

1.      在DMEM完全培养液中培养贴壁细胞。转染前一天，把细胞换到含有0.5μg/ml四环素-HCl（四环素）的DMEM完全培养液中。每个10 cm培养皿中加入足量细胞，使转染那天，细胞可以有33%的汇合度。

2.      在合适的限制性内切酶位点使质粒线性化，并把每秒质粒的浓度调整为≥0.5 mg/ml。10～20μg质粒pTet-tTAk和1～2μg pSV2-His（Tet质粒与带选择标记的质粒的摩尔比大约为10：1）与500μl HEPES缓冲液在一个干净的4 ml聚丙乙烯管中混合。

3.      DNA混合物中加入32.5μl 2 mol/L CaCl₂。立即轻轻振荡使溶液混匀。溶液在室温保存，不时地混匀。15～30 min后会形成絮状沉淀。

4.      吸掉步骤1准备的细胞培养皿中的所有培养液。

5.      用巴斯德吸管混合CaCl₂-DNA若干次。滴加混合物，使它均匀地盖在单层细胞上。

6.      细胞在37℃，5% CO₂条件下培养30 min，15 min后摇动培养皿，保证DNA沉淀物的均匀覆盖。

7.      每个细胞培养皿中加入10 ml含有四环素的DMEM完全培养液。细胞在37℃，5% CO₂条件下培养4～5 h

[1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] 下一页