磷酸化化学计量的确定及磷蛋白形成动力学的测定

l      磷酸化作用化学计量的确定

1．在冰上建立下列反应混合液：

Tris-HCl（50mmol/L；pH8.0）/MgCl₂（10mmol/L）        250μl

ATP（10mmol/L）                                       1μl

纯化的DNA结合蛋白（1mg/ml）                         4μl

[γ^-32P]ATP（13μCi）                                 1.3μl

2．将反应液混合物分成125μl的两个部分，记为A部分和B部分。B部分将被用于动力学实验。

3．在6个干净管中各加入20μl A部分溶液，然后各管中依次加入0，0.5，1，2，3和4微单位的蛋白激酶以开始磷酸化测试。室温下反应30分钟。

4．将10μl每一磷酸化测试混合液点在一张2cm×2cm的Whatman 3MM滤纸上，将该滤纸在10％TCA/1%焦磷酸钠溶液中洗10分钟（每张滤纸用5ml溶液）。更换溶液重复洗两次。用100％乙醇洗滤纸。通过对每张滤纸所发出放射性的计数来确定每个样品中磷蛋白的掺入量。

5．在每个管中加入1.1μl 100％TCA以沉淀管中剩余的10μl磷酸化测试混合液。在冰上放置20分钟，室温下用微型离心机在10 000r/min离心10分钟以收集蛋白质沉淀。先用90％后用100％丙酮洗沉淀。在空气中干燥沉淀5分钟。

6．将样品加到SDS－聚丙烯酰胺凝胶的加样孔中，在160V下1×电泳缓冲液（10×贮液配制）中电泳40分钟。用Saran®膜包裹湿胶，对X光片曝光3小时左右。

7．以放射自显影胶片为模板，切下与DNA结合蛋白相对应的被标记的条带。用5倍体积30％过氧化氢在37℃处理凝胶条带6～12小时以溶解DNA结合蛋白。通过对每个样品的契仑科夫放射的计数来确定磷蛋白的掺入量。

8．用以下两种方法测定待测液中的总掺入量：

a． 将9μl分析缓冲液（50mmol/L Tris-HCl pH8.0/10mmol/L MgCl₂）加到1μl A部分溶液中，将混合液点在一张2cm×2cm的Whatman 3MM滤纸上。不要用TCA处理滤纸。对滤纸所发出的放射性进行计数。

b．将1μl A部分溶液加到适当体积的30％过氧化氢溶液中，并对契仑科夫放射性进行计数。

9．计算掺入到蛋白质中的磷酸的莫尔数。在本实验中，每个分析包含800 pmol ATP和8 pmol（0.3μg）蛋白（如果待测DNA结合蛋白是GBF1的话，其分子量为37 000）。1％掺入蛋白中的放射性相当于每莫尔蛋白含有1摩尔磷酸。

  

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