放射性标记DNA探针的制备

l      聚丙烯酰胺凝胶的制备

1．按照（三）中操作流程灌制非变性聚丙烯酰胺凝胶。将10×TBE稀释成0.5×的工作浓度。聚丙烯酰胺的工作浓度取决于待测DNA片段的大小，200bp左右的片段需要4～5％的凝胶，小于100bp的片段应灌制6～8％的凝胶。

 

l      DNA的标记

1．用两种限制性内切酶从10μg质粒上将待测DNA片段切下。注意务必使至少一种酶酶切后产生5’凸出末端。酶切体系终体积50μl，在适宜的酶反应缓冲液条件下反应1小时。

2．向酶切反应混合液中加入

[α－³²P]dATP（约10μCi/μl）(若5’凸末端含T残基)            10μl

dCTP(2mmol/L)                                               1μl

dGTP(2mmol/L)                                               1μl

dTTP(2mmol/L)                                               1μl

DNA聚合酶（Klenow片段）（5单位/μl）                       1μl

室温温育反应体系30分钟。

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