相互作用在生理上的证实和探索

l      通过免疫共沉淀确定结合蛋白

1．用磷酸盐缓冲液洗30块10 cm培养板上的适宜细胞。刮去每块板上的细胞到1 ml冰冷的EBC裂解缓冲液中。

2．将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中，在微量离心机上4℃以最大速度离心15 min。

3．收集上清（约30 ml）并加入30μg的适当抗体，4℃摇动免疫沉淀物1 h。

4．加入0.9 ml的蛋白质A-Sepharose 悬液，4℃摇动免疫沉淀物30 min。

5．用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物，再重复洗5次。最后，用NETN洗一次。

6．吸出混合物的液体部分。加入800μl的1×SDS胶加样缓冲液到球珠中，煮沸4 min。

7．将样品加入到大孔的不连续SDS-PAGE梯度胶中，在10 mA的恒定电流下电泳过夜。

8．通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带。

9．从胶上切下目标带，将其放到微量离心管中，用1ml 50%乙腈洗两次，每次3 min。

10．  用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质，再将肽电洗脱。

11．  通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的肽在ABI 477A或494A机器上进行自动Edman降解测序。