胚胎中细胞基因打靶方法

置换型设计物的制备

1．选择靶基因的一个部分作为设计物的组成，还包括有靶基因的另一个部分作为Southern杂交探针，以鉴定细胞中是否已发生同源重组之用。

2．在质粒载体中构建一个克隆；neo基因能阻断靶基因的表达，在neo的两侧保持保留同源区；在同源区外的置换型设计物中包含一个胸腺嘧啶激酶（TK）基因。

3．用限制性内切酶消化设计物DNA使成线形；设计物DNA线形化后，质粒DNA仍附于在TK基因上。如果设计物在基因组发生随机插入中出现任何DNA序列丢失时，线性态有助于保持TK基因的活性。

4．用酚/氯仿抽提设计物DNA。

5．用加两个体积的95％乙醇沉淀，微型离心机离心30秒，去上清，使沉淀物干燥到仍保持微湿润状态。

6．把沉淀物溶于100μl水中，检测是否已被彻底消化，在凝胶电泳中测定DNA的浓度。

 

转染设计物和ES细胞的选择

7．把细胞培养在ES/LIF培养基中；每2～3天传代细胞，把细胞接种到100mm凝胶培养皿上，每皿1～2×10⁶细胞。

8．用胰蛋白酶/EDTA消化收集细胞达5×10⁶～1×10⁷；消化5分钟，令细胞完全脱壁，用吸管吹打使分散成单细胞，加5ml ES培养液，用1ml电击液重悬于同一管中。

9．加1 pmol消毒线性DNA。

10．  450V，250μF在4mm电击小室中进行电击；室温中培养10

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