RNA酶保护试验

作者：佚名    实验频道来源：生物谷    点击数：    更新时间：2004-6-18

RNA酶保护试验((RNase Protection Assay,RPA)是通过液相杂交的方式,用反义RNA探针与样品杂交，以检测RNA表达的技术。与Northern杂交和RT-PCR比较，RPA有以下几个优点： 1． 检测灵敏度比Northern杂交高。由于Northern杂交步骤中转膜和洗膜都将造成样品和探针的损失，使灵敏度下降，而RPA将所有杂交体系进行电泳，故损失小，提高了灵敏度。 2． 由于PCR扩增过程中效率不均一和反应“平台”问题，基于PCR产物量进行分析所得数据的可靠性将下降，而RPA没有扩增过程，因此，分析的数据真实性较高。 3． 由于与反义RNA探针杂交的样品RNA仅为该RNA分子的部分片段，因此，部分降解的RNA样品仍可进行分析。 4． 步骤较少，耗时短。与Northern杂交相比，省去了转膜和洗膜的过程。 5． RNA-RNA杂交体稳定性高，无探针自身复性问题，无须封闭。 6． 一个杂交体系中可同时进行多个探针杂交，无竞争性问题。 7． 检测分子长度可以任意设置，灵活性大。     RPA的缺点是需要同位素标记探针。 一、试剂准备 1． GACU POOL：取100mM ATP、CTP、GTP各2.78μl、100mM UTP 0.06μl，加DEPC H2O至100μl。 2.    杂交缓冲液:PIPES 0.134g、0.5M EDTA（pH8.0）20μl、5M NaCl 0.8ml、甲酰胺8ml，加DEPC H2O至10ml。 3.    RNase消化液：5M NaCl 120μl、1M Tris-HCl(pH7.4) 20μl、0.5M EDTA（pH8.0）20μl、RNase A(10mg/ml) 8μl、RNase T1(250U/μl) 1μl，加DEPC H2O至2ml 二、操作步骤 1．反义RNA可由含T7或SP6启动子的重组质粒为模板制备，也可以用含启动子的PCR产物为模板制备，本文介绍后者。 （1）设计含T7启动子的PCR引物    由于PCR产物将作为合成反义RNA的模板，所以一对引物中的下游引物5’-端要含T7启动子序列:         T7启动子序列为：5’-TAATACGACTCACTATAGGG 　     引物设计的其他要求与一般PCR引物的设计相同。PCR产物的长度决定了反义RNA探针的长度，具体设计时可考虑100-400bp长。最好采用巢式PCR，即先扩增出一较长的片段，再以该片段为模板扩增出较短的片段，以保证探针的特异性，如下图所示：   上游引物 下游引物Ⅱ T7 启动子序列 下游引物Ⅰ     （2）PCR    先用上游引物和下游引物Ⅰ进行PCR，再以PCR 产物为模板,用上游引物和下游引物Ⅱ-T7进行二次PCR(具体操作参见PCR章节)。 （3）探针合成标记与纯化      在0.5ml 离心管中加入下列试剂： RNasin （40U/μl）                          0.5μl GACU POOL GAC （含GTP、CTP、ATP各2.75 mM,UTP 61μM）      2μl [α-32P]UTP(10μCi/μl)                        2.5μl DTT (二硫苏糖醇，0.1M)                        1μl 5×转录 buffer                                2μl 模板（50ng/μl）                             1μl T7 RNA 聚合酶  (15U)                         1μl 混合后，短暂离心，37OC保温1hr。 加入DNaseⅠ（10U/μl）1μl, 37OC 15min, 然后75 OC 10min以灭活DNAseⅠ和T7 RNA 聚合酶。 加入：饱和酚                                50μl 氯仿                                  50μl 酵母tRNA（2μg/μl）                  4μl DEPC H2O                              100μl   室温下充分混匀，离心10000g×2min。取上层液置另一0.5 ml离心管中，加入100μl氯仿，混匀，离心10000g×2min。将上层液转移至另一0.5ml 离心管中，再加入3M NaAc 10μl、预冷无水乙醇250μl，混匀后，-20OC静置30min。4OC离心13500g×10min。弃上清液，沉淀用75%乙醇100μl洗涤，4OC离心13500g×2min, 弃上清液。室温下挥发残留乙醇。加入50μl杂交缓冲液溶解沉淀，4OC下保存待用。可用尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测探针质量。（参见本节电泳步骤）。 2．杂交 （1）        RNA提取后溶解在杂交缓冲液中，浓度为1μg/μl。 （2）取8μl RNA加入1-3μl探针（根据探针检测结果调整）于0.5ml 离心管中。 （2）        80OC保温2min，然后40-45OC下杂交12-18hr。 3. 消化 (1) 杂交管于37 OC保温15min，加入RNase消化液，37 OC保温30min。 (2) 加入10%SDS 10μl、10μg/μl蛋白酶K 20μl，混匀，37 OC保温10min。 (3) 加入65μl饱和酚和65μl氯仿，混匀，室温离心，10000g×2min。  (4) 转移上层液到另一0.5离心管中，加入10μl酵母tRNA和3M NaAc 15μl，再加入200μl异丙醇，混匀后，置-20OC 30min，4 OC离心,135000g×10min。 (5)   弃上清液，室温下挥发乙醇，加入5-8μl上样缓冲液溶解沉淀。 4、电泳与放射自显影 （1）配制凝胶：(50ml)     40%丙烯酰胺-亚甲双丙烯酰胺（19：1）       6.25ml         5×TBE                                 10ml         尿素                                    24g 加H2O至50ml    溶解后加入25%过硫酸胺50μl，TEMED 50μl，混匀，注入电泳槽中，插入梳，待胶凝固。 （2）预电泳     以1×TBE为上下槽电泳缓冲液，加上电压后进行预电泳，如果用测序电泳装置，电压应达2000v以上，功率设定为100w，温度设为50 OC。待胶板温度达50 OC时，暂停电泳，准备加样。 （3）加样     将已溶解在加样缓冲液中的样品80 OC加热2min，立即加样到胶孔中，电泳1-2hr。（电泳条件同预电泳）。 （3）        电泳结束后，打开胶板，用滤纸取下胶，覆上一层保鲜膜，放置于暗盒中，暗室红光下，压上一张X片，盖上暗盒，-70OC曝光1-3天。暴光结束后，将X光片显影、定影、水洗、晾干。   三、注意事项   1．本实验大部分为RNA操作，注意RNA酶的污染。 2．RNase消化液消化未杂交的单链RNA和探针RNA，当探针与样品之间有碱基错配时，错配位点也将被消化，因此会产生片段较小的杂交片段。因此进行PCR时，采取尽量减少错配的措施。 3、 同位素对RNA合成有一定影响，有时会产生非全长的探针。因此，标记时间不宜过长。 4、 RNase消化液有时会产生过度消化而无检测信号，可以将消化液稀释10-100倍后使用。 　 处理 SSI 文件时出错