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重组蛋白纯化方法---提取 |
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来源：互联网 作者：未知 发布时间：2006-12-16
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狭义来讲，提取指制备物与细胞固体成分或其它结合成分的分离，由固相转入液相或从细胞内生理状态转入外界特定溶液环境的过程，即分离前期被提取物从破碎的细胞中释放出来的过程。如果被提取物程固相或与固体结合，提取时由固相转入液相，常称为固液萃取；如果被提取物已经呈液相存在，提取时由一液相转入转入另一互不相溶的液相，这种方法称为液液萃取。
广义来讲，提取又可称为抽提或萃取，贯穿在整个分离纯化过程中，如核酸制备中用氯仿或苯酚反复抽提除去蛋白质，分离DNA和RNA。
提取的好坏受到多种因素的影响，包括：
1）溶液 涉及到溶液中的保护成分、离子强度、PH值、温度、表面活性剂、变性剂（如尿素和盐酸胍）和粘稠度、溶液的更换；
2）材料 包括材料本身固有的特性、材料的选择和处理；
3）目的分子 目的分子的理化性质、存在方式和部位、含量；
4）其它因素 搅拌、提取时间的长短。
第一节 溶剂和溶解度
一. 溶剂
一些常用溶剂按其极性的大小，可依顺序大体排列如下：饱和烃类<全卤代烃类<不饱和烃类<醚类<未全卤代烃类～脂类<酮类<醇类。
还可按形成氢键能力的大小，分为五类：
1）能形成两个以上氢键的溶剂分子 如水，其两个氢原子和一个氧原子都可以形成氢键；
2）能形成两个氢键的溶剂分子 既是氢键的供体又是氢键的受体，例如脂肪族的醇类；
3）只作质子受体的溶剂分子 如脂肪族的醚类；
4）只作质子供体的溶剂分子 如氯仿；
5）不能形成氢键的烃类 如四氯化碳。
1）和2）两类溶剂宜用于极性化合物的提取，3）和4）两类溶剂宜用于对溶液中弱极性或非极性化合物的提取。
二．溶解度
溶解度用于分离提纯有两个主要目的：1）选择一个对制备物溶解度大而对杂质溶解度小的溶剂，使制备物从组分中有选择地被孤立出来；2）或选择一个对制备物溶解度小而对杂质溶解度大的溶剂，使制备物从组分中沉淀或结晶出来。
1． 物质溶解性质的一般规律可归纳为如下几点：
1）极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性溶剂中；
2）碱性物质易溶于酸性物质中，酸性物质易溶于碱性物质中；
3）在极性溶液中，溶剂介电常数的减少伴随溶质溶解度的降低。
总之，符合"相似相溶"原则。
2． 影响物质溶解度的几个主要因素：
1）离子强度
A．有些物质，如DNA-蛋白，在高离子强度下溶解度增加。
B．另一些物质，如绝大多数球蛋白和酶，在低离子强度下溶解性增加，称为盐溶；而在高离子强度下溶解度下降，直至出现沉淀，称为盐析。
C．盐溶现象不仅在水溶液中发生，而且在低介电常数溶剂，如乙醇，也同样发生。故而稀盐液常用于大多数生化物质的提取。
2）PH 值
A．两性溶质分子，在等电点时易相互聚集，溶解度最低；而在远离等电点两侧的PH值时，溶解度增大。
B．一些酸性或碱性小分子物质，在PH值很低时酸性物质呈现非解离分子状态，而碱性物质呈现阳离子状态；反之，酸性物质呈现阴离子状态，而碱性物质呈现非解离分子状态。离子状态的物质，不论是阳离子或阴离子都易溶于水，非离子的分子状态则易溶于有机溶剂。
C．对蛋白质、酶、核酸等生物大分子来说，应避免过酸或过碱，一般控制在PH6-8范围。如单纯从溶解度考虑，等电点在酸性范围的蛋白或酶，可选用偏酸性溶液提取；等电点在碱性范围内，则选用偏酸性溶液提取，酸性条件还可解离目的蛋白与其它组分形成的离子键，并有利于细胞的溶解。
3）温度
A．温度的提高可增高物质的溶解度，减少溶液的粘度，有利于提取的进行。对于一些植物成分或某些小分子生化物质，提取温度常在50-70度。
B．热提取法虽然提高提取效率，但所得提取液含杂质较多，不如冷提取法。对绝大部分生物大分子而言，提取温度一般控制在0～10度之间，以防止生物大分子的变性。
4）去垢剂
去垢剂(表面活性剂)是一类即具有亲水基又具有疏水基的物质，一般具有乳化、分散、和增溶作用，可分阴离子、阳离子和中性去垢剂等多种类型，中性去垢剂在蛋白提取钟应用的较多。
A．中性去垢剂 又称非离子表面活性剂，对蛋白质的变性作用影响较少，宜于蛋白质或酶提取之用。一般市售中性去垢剂有聚乙二醇类，如PEG200；多元醇类表面活性剂，如山梨醇、司盘类和吐温类；聚氧乙烯脂肪醇醚，如苄泽类、平平加类；聚氧乙烯烷基苯酚醚，如Igepal CO、乳化剂OP、Triton、Pluronic(用作消泡剂、润湿剂、增溶剂)、泡敌。中性去垢剂作用后可通过Sephadex LH-50柱除去；也可直接上DEAE-Sephadex柱层析分离目的蛋白，不必先除去去垢剂。
B．阴离子去垢剂 常见的有十二烷基硫酸钠和十二烷基璜酸钠。前者可促进核蛋白的溶解，将核酸释放出来，并对核酸酶有一定抑制作用，常用于核酸的提取。
C．阳离子去垢剂 如洁尔灭、新洁尔灭、CTAB、CPC、ZEPH、克菌定、消毒净（TMPB）、杜灭芬等，消毒灭菌类居多。
D．天然表面活性剂 又称为生物表面活性剂，包括种类较为广泛，如各种树胶（阿拉伯胶、杏胶、桃胶、果胶）、明胶、皂甙、卵磷脂、豆磷脂、琼脂、海藻酸钠、酪蛋白、胆甾醇、胆酸类、多糖类（如环糊精）等。
E．两性表面活性剂 在碱性水溶液中呈阴离子表面活性剂的性质，起泡性好，去污力也强；在酸性溶液中则呈现阳离子表面活性剂特征，其杀菌性很强。
5)变性剂
蛋白质变性剂的作用是破坏蛋白质的次级键，如氢键、盐键和疏水力，引起天然构象的解体；它们并不破坏共价键，如肽键和二硫键，故不涉及一级结构的改变。变性剂有溶解型和沉淀型两类，SDS、尿素和胍盐是有效的溶解型变性剂，而三氯乙酸、甲醇、和氯仿/异戊醇是有效的沉淀变性剂。一般而言，变性剂应用时常大大过量，破坏氢键的变性剂用量至少两倍于氨基酸的克分子数，如1克蛋白质可可结合1.4g。 SDS溶于水可达25%，对温度敏感，W/V贮存液最为方便。需要注意的是SDS的钾盐是不溶性的，所以SDS溶液中要避免混入钾盐。 尿素极易溶于水，可达10mol/L,在8mol/L以上要注意温度以防止沉淀。尿素在水中缓慢分解形成氨及高度活性的氰酸离子，故要防止高温。 三氯乙酸与过氯酸（TCA，PCA）都是极好的沉淀剂，能沉淀蛋白质和核酸，前者应用更为广泛。
第二节 提取方法
一．固液萃取
在固液萃取中，提取物是由固相转为液相，或由细胞内转为细胞外，其提取效率与物质的扩散作用有关。
为了增加扩散物质的量，也就是提高提取速度，常采用如下措施：
1）提高材料的破碎程度，以增加扩散面积，减少扩散距离；
2）进行搅拌，使已扩散的溶质迅速与溶剂混匀，以保持两项界面最大浓度差，或分多次提取，不断更换新鲜溶剂，以提高扩散速率；
3）延长提取时间，提高提取温度，以及减少溶液粘度（如属大分子核酸干扰，加入少量鱼精蛋白或硫酸链霉素沉淀除去）等。
实际上从破碎后的固体细胞提取所需组分，当细胞破碎程度及提取温度受到限制时，采用少量多次提取方法较为有利。
二．液液萃取
液液萃取选用的溶剂必须与被抽提的溶液互不混合、且对被抽提的溶质有选择性的溶解能力。最常用的液液萃取溶剂为二相溶剂，水或水-醇为一相，与水互不相溶的各种碳氢化合物，如低级醚、酯、苯酚等，为另外一相。
第三节 蛋白质和酶的提取分离
一．蛋白质及其溶解性质
蛋白质有多种分类方法：
1） 按其功能 活性蛋白和非活性蛋白
2） 按其结构 简单蛋白和结合蛋白
3）按其溶解度 水溶性蛋白、醇溶蛋白、硬蛋白（不溶于水、稀酸、稀碱和有机溶剂，遇强酸或强碱溶解）。一般来说，大部分蛋白可溶于水、稀酸、稀碱或稀盐溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂。
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