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重组蛋白纯化方法---提取 |
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来源：互联网 作者：未知 发布时间：2006-12-16
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二．蛋白质的一般提取方法
1． 水溶液提取
凡能溶于水、稀盐、稀酸或稀碱的蛋白质，一般可用稀盐或缓冲溶液进行提取，稀盐溶液和缓冲溶液，有利于稳定蛋白结构和增加蛋白质溶解度。
此时应考虑以下因素：
1）提取液体积 加入量太少则提取不完全，加的过多则不利于浓缩，一般为原材料的3-6倍的体积，可一次或分次提取。
2）盐浓度 一般在0.02-0.2M的范围内，常用的稀盐和缓冲液有0.02-0.05M磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、0.09-0.15M的氯化钠等。在某些情况下，也用到较高的盐浓度，如提取脱氧核糖蛋白及膜蛋白。有时为了螯合某些金属离子和解离酶分子与其它分子的静电结合，选用柠檬酸缓冲系统和焦磷酸缓冲液可获得较好效果。
3）pH值 一般在被提取蛋白质的等电点的两侧，碱性蛋白用稀酸提取、酸性蛋白用稀碱提取。在某些情况下，为了破坏所分离的蛋白质与其他杂质的静电结合，选择偏酸（pH3-6）或偏碱（pH10-11），可以使离子键破坏而获得单一的蛋白成分。
4）温度 提取时通常要求低温操作。只有对某些耐高温的蛋白质或酶（如胃蛋白酶、酵母醇脱氢酶及某些多肽激素。
5）提取时常缓慢搅拌，以提高提取效率
6）有时为了破坏蛋白质与其它物质的离子键或氢键的结合，加入少量的多价阴离子也有助于蛋白提纯。
2． 有机溶剂提取
一般和脂质结合比较牢靠或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，难溶于水、稀酸、稀盐和稀碱，常用有机溶剂提取。他们同时有亲脂性和亲水性，如丙酮、异丙醇、乙醇、正丁醇等。其中正丁醇应用的较为广泛，能在水和脂分子间起着类似去污剂的桥梁作用，由于丁醇与蛋白质极性基团结合的竞争力比脂质大，所以可取代蛋白质与脂质的结合位置，使原来蛋白质在水中溶解度大大增加。
有些蛋白和酶即能溶于稀酸、稀碱，又能溶于一定比例的有机溶剂。在这样的情况下，采用稀的有机溶剂提取可防止水解酶的破坏，并兼容除杂和提高提取效果的作用，现举例说明：
胰岛素可溶于稀酸、稀碱和稀醇溶液，针对组织中共存的糜蛋白酶对胰岛素有极高的水解活性，可采用68%酒精溶液并用草酸调至PH2.5-3.0,这样便能在三方面抑制了糜蛋白酶的活性：
1）68%酒精可以使糜蛋白酶暂时失活；
2）草酸可以除去激活糜蛋白酶的金属离子钙；
3）PH2.5-3.0是糜蛋白酶不适于作用的PH值。
而以上条件对胰岛素的溶解度和稳定性并没有影响，并可以除去一部分在稀酸及稀醇中不溶解的杂蛋白
垂体前叶ACTH常采用酸性70%丙酮，其设计原理是酸性可以促使ACTH的溶解，而70%浓度丙酮对ACTH的溶解度没有影响，却大幅度地降低其他杂蛋白的溶出，对提高分离纯化的效果极为明显。
3． 从细胞膜上提取水溶性的蛋白质和酶方法：
膜上的蛋白质或酶一般有两种存在方式：一种在膜表面上，与膜成分结合较松，经过充分粉碎细胞，在一定PH范围用稀盐溶液即可提取分离；一种是膜的内在成分之一，或与膜结合十分紧密，提取十分困难，需用超声波、去污剂、或其他比较强烈的化学处理，一般常用方法有如下几种：
1）浓盐或尿素等溶液提取 如NaClO4、尿素、盐酸胍等。当以上溶液浓度达到2M时，可抽去27%以上的膜蛋白，但这样的条件易引起蛋白质和酶的变性。
2）碱溶液提取 在PH8-11范围内，某些膜蛋白随着PH值的提高而溶解度大大增加，但碱提取法也容易引起蛋白酶和酶的失活，应用上不广。
3）加入金属螯合剂 蛋白质通过金属离子与膜成分结合时，加入金属螯合剂如EDTA可使蛋白质释放出来。
4）有机溶剂提取 使用乙醇、吡啶、叔戊醇、正丁醇是抽提膜上结合或内在脂蛋白最常用也最为有效的方法。如正丁醇可在广泛的PH值（3-10）温度范围内（-2- +40）内使用。
5) 去垢剂处理 用去垢剂分离膜蛋白时，要考虑两点要素，去垢剂的溶解能力和去垢剂的温和性。强阴离子去垢剂，如SDS，一般具有很好的溶解性能，但温和性不够理想，容易引起蛋白质变性；弱离子型或非离子型去垢剂对蛋白变性影响较小，但溶解能力较差。根据报道，Triton 100用于提取ADP/ATP载体蛋白时，由于作用较为温和，故所得蛋白活性要高于使用其他去污剂。 去垢剂的溶解能力与溶液的离子强度有关，一般说两者呈现正比关系。
第四节 提取时的保护性措施
提取一些具有生理活性的物质时，除了考虑被提取物溶解度外，还应考虑被提取物活性的保护。对于一些生物大分子如蛋白质、酶和核酸来说，主要措施有如下几点；
1．采用缓冲系统 防止提取过程中某些酸碱基团的解离，造成溶液中PH值变化幅度过大，导致某些活性物质的变性、或由于PH变化影响提取的效果。在生化制备中，提取中常用的缓冲系统有磷酸盐缓冲液、柠檬酸缓冲液、Tris缓冲液、醋酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液和巴比妥缓冲液等。
[缓冲液] 分为非-双性离子缓冲化合物类和双性离子缓冲化合物类。前者包括HCl-KCl、甘氨酸-HCl、乌头酸盐-NaOH、柠檬酸盐-磷酸盐、柠檬酸盐-NAOH、醋酸盐、琥珀酸盐、顺丁烯二酸盐-NAOH、磷酸盐、TRIS-HCL、硼酸-硼砂、甘氨酸-NAOH、碳酸盐-碳酸氢盐等，存在反应性和缓冲能力有限等缺点。双性离子缓冲液虽然具有很多优点，但依然存在反应性与不适应性的问题，如HEPEs是氨基丁酸的拮抗性（反应性）、不适应于所有的组织培养（不适应性）。
2．加入保护剂 防止某些生物活性物质的活性基团及酶的活性中心受到破坏。如最常见的巯基，是许多活性物质和酶催化的活性基团，极易被氧化，故提取时常加入一些还原剂。一些易受重金属离子抑制生理活性的物质，加入某些金属螯合剂，把有害金属离子螯和掉，而保持被提取物的活性。 [螯合剂和巯基试剂] 巯基试剂在生化反应中有两个用途，一是防止蛋白质或酶等分子中的SH-基氧化成S-S，二是某些酶反应中维持体系的还原环境。经常应用的巯基试剂有二硫丁醇类化合物（如二硫苏糖醇DTT、二硫赤酰糖醇DTE）和2-巯基乙醇，谷胱甘肽也经常应用。一般来说二硫丁醇类是常选用的巯基试剂，不仅是因为挥发性低，难闻的气味较少，而且氧化电位低，比2-巯基乙醇浓度低很多的情况下，可以使其他二硫化合物完全还原。螯合剂用于控制反应中金属离子浓度或去除金属离子，常用的螯合剂有EDTA（乙二胺四乙酸）、EGTA、1,10-二氮杂菲、柠檬酸和磷酸等。
3．抑制水解酶的破坏 根据不同水解酶的性质采用不同方法。如需要金属离子激活的水解酶，常加入EDTA或用柠檬酸缓冲液除去溶液中的某些金属离子，使酶的活性受到抑制；对热不稳定的水解酶，可以用热提取法使之失去作用；或选用PH范围，使酶活性最低；还可针对性地加入某些抑制剂，以抑制水解酶的活性，但此类方法在蛋白提取中应用较少。
4．其它一些特殊要求的保护措施 除避免紫外线、强烈搅拌、过酸过碱、高温、冻结等情况外，有些蛋白质在提取时还有特殊要求，如固氮酶钼-铁蛋白，必须在无氧条件下进行。
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