2. 准备好一个90mm培养皿，称1.82克D－甘露醇于20ml双蒸水中。培养皿的盖子用来切叶片。

 

3. 取4周后未抽台前的叶片，约90片。切成1mm宽的长条，置于甘露醇溶液中。可以一边切一边从植株上取。

 

4. 配酶解液，100ml三角瓶，15ml酶解体系。

 

5. 将步骤3中细条捞出，置于酶解液中。黑暗，23℃，40-50rpm酶解3小时。

 

6. 酶解液过100-200目的筛子，将过滤后的绿色混合物置于15ml离心管（直径约1cm）中，均分为两管。4℃，60 g，15min，brake 设为4-5。

 

7. 弃上清，沉淀用冰冷的W5溶液轻柔洗涤，每管4ml。4℃，100 g，1min，brake 设为4-5。

 

8. 弃上清，沉淀用冰冷的W5溶液轻柔洗涤，每管4ml。冰上放置30min。

 

9. 23℃，100 g，1min，brake 设为4-5。弃上清，每管沉淀用0.5ml MaMg重悬。（本步骤及以下操作均在23℃。）

 

10. 取约10-20ug 质粒于1.5ml EP管中，加100ul 步骤9中的原生质体。用200ul 枪头（剪去前端）轻柔混匀。

 

11. 加入110ul PEG/Ca 溶液，轻柔混匀。放置20-30min。

 

12. 加入0.44ml W5 溶液，来回颠倒混匀。23℃，100 g，1min，brake 设为4-5。

 

13. 弃上清，加100ul W5，混匀。加900ul W5，混匀。

 

14. 上述混合液体置于六孔板内，23℃，弱光，孵育6-18小时。

 

15. 荧光观察。

 

 

 

Solution Recipes

 

 

 

Enzyme solution

 

1ml 15％cellulase R10 (RS is too strong)

 

1ml 0.3％macerozyme R10 (Yakult Honsha, Tokyo, Japan)

 

1.09 g mannitol

 

1ml 0.3M KCl

 

1ml 0.3M MES, pH 5.7

 

Heat the enzyme solution at 55oC for 10 min (to inactivate proteases and enhance enzymesolubility) and cool it to room temperature before adding

 

1ml 0.15M CaCl2

 

1ml 0.75mM β-mercaptoethanol

 

1ml 1.5% BSA

 

 

 

PEG solution (40%, v/v)

 

1 g PEG4000 (Fluka, #81240) **Very Important!!

 

0.75 ml H2O

 

0.625 ml 0.8 M mannitol

 

0.25 ml 1M CaCl2

 

 

 

W 5

 

1000 ml

 

154 mM NaCl 9.0 g

 

125 mM CaCl2 18.4 g

 

5 mM KCl 0.37 g

 

5 mM glucose 0.9 g

 

0.03% MES 0.3 g

 

pH to 5.8 with KOH

 

autoclave 20 minutes in 125 bottles

 

 

 

MaMg solution

 

100 ml

 

15 mM MgCl2 1.5 ml 1M MgCl2

 

0.1% MES 0.1 g

 

0.4 M mannitol 7.3 g

 

pH to 5.6 with KOH

 

autoclave 20 minutes in 125 ml bottles

 

 

 

 

 

References

 

 

 

1. Sheen, J. 2002, A transient expression assay using Arabidopsis mesophyll protoplasts. http://genetics.mgh.harvard.edu/sheenweb/

 

2. Doelling & Pikaard. 1993, Transient expression in Arabidopsis thaliana protoplasts derived from rapidly established cell suspension cultures. Plant Cell Reports 12: 241-244.