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蛋白复性（二）-基因重组蛋白质的体外复性
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日期：2006-08-06 23:39:45
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| 摘要 基因重组蛋白在大肠杆菌中表达时，由于表达量高，往往形成无生物活性的包涵体。包涵体必须经过变性和复性的过程才能获得有活性的重组蛋白。如何提高基因重组蛋白质的复性率，是生物工程技术的一个研究热点。对近年来的重组蛋白质的复性方法做一评述，为研究蛋白质 |
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酶切反应建议
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日期：2006-08-06 23:39:45
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| 一、 建立一个标准的酶切反应 目前大多数研究者遵循一条规则，即10个单位的内切酶可以切割1g不同来源和纯度的DNA。通常，一个50l的反应体系中，1l的酶在1X NEBuffer终浓度及相应温度条件下反应1小时即可降解1g已纯化好的DNA。如果加入更多的酶，则可相应缩短反应时间； |
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原位杂交操作规程
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日期：2006-08-06 23:39:45
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| （一）、仪器设备 医用微波炉； 水浴锅。 （二）、试剂 0.2mol/L HCl ： HCl 8.2ml ， H20 定容 0.5L 。 0.1mol/L 三乙醇胺 (pH8.0): 三乙醇胺 5.33ml ， H20 定容 0.4L 。 .5ml/L 醋酸 -2.5ml/L 醋酸酐 : 三乙醇胺 13.2ml ， NaCl 5g ，浓 HCl 4ml ， H20 定容 0.98L |
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液相色谱法简介
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日期：2006-08-06 23:39:45
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| 气相色谱 不能由色谱图直接给出未知物的定性结果，而必须由已知标准作对照定性。当无纯物质对照时，定性鉴定就很困难，这时需借助质谱、红外和化学法等配合。另外大多数金属盐类和热稳定性差的物质还不能分析。此缺点可高效液相色谱法来克服。在经典液相色谱的基础上， |
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质粒DNA的小量制备
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日期：2006-08-06 23:39:45
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| （一）细菌的收获和裂解 １．收获 １）将2ml含相应抗生素的LB加入到容量为15ml 并通气良好（不盖紧）的试管中，然后接入一单菌落，于30℃剧烈振摇下培养过夜。 ２）将1.5ml培养物倒入微量离心管中，用微量离心机于4℃以12000g离心30秒，将剩余的培养物贮存于4℃。 ３） |
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Southern印迹杂交
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日期：2006-08-06 23:39:45
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| （一）滤膜的准备 提取基因组（染色体） DNA 用适当限制性内切酶（如 Bam HI、 Eco RI、 Hin dIII或 Pst I）消化DNA， 重蒸水 11l 基因组 DNA 5l（3-5g） 10缓冲液 2l 限制性内切酶 2l 总量为 20l 3. 37℃条件下保温10-24小时。 4. 取2l样品在0.7-1%凝胶上在TBE溶液中 |
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cDNA第一链的合成
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日期：2006-08-06 23:39:45
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| 通过体外无细胞系统翻译找出目的基因mRNA以后，变可进行cDNA第一链的合成，其步骤包括： 1）在Ependorf管中加50pmol/L的一种α32PdNTP和1mg/ml的mRNA 10μl（10μg），100m mol/L甲基氢氧化汞1μl，室温反应l0分钟，使RNA变性。 2)加100m mol/L的β-巯基乙醇2μl和10m |
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cDNA第二链的合成
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日期：2006-08-06 23:39:45
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| 1)离心沉淀cDNA第一链，并重悬在50μl水中，加50μl 2×第二链缓冲液(0.2mol／L Hepes，pH6.9，20m mol／L MgCl2，5 m mol／L DTT，0.14 mol／L KCl，1 m mol／L 4种Dntp)，混合均匀。 2)每微克底物加大肠杆菌DNA聚合酶K1enow片段20～50单位，15℃反应20小时，此酶能识 |
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PRINS步骤
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日期：2006-08-06 23:39:45
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| 1、常规脱蜡浸入0.01mol/LPBS； 2、用0.2mol/L盐酸处理5min； 3、蛋白酶K(25g/m1)消化37℃ 15min； 4、分别用80％，95％和100％酒精脱水，室温干片； 5、加PCR混合液25L(10mmol/L Tris-HCl，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，各加200mol/L dATP，dCTP，dGTP，1.5mmol/L d |
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质粒的酵母直接转化
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日期：2006-08-06 23:39:45
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| 1．用牙签从平板中挑取单菌落（直径2～3mm），转移到1.5ml的无菌离心管中。 2．将10l载体DNA（100g）与10l转化质粒DNA混合，振荡均匀。（若转化DNA是用未经RNA酶处理的mini－prep DNA方法制得，则不需加载体DNA）。 3．加0.5ml PLATE溶液，振荡。 PLATE溶液： 40％聚乙 |
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SMART技术
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日期：2006-08-06 23:39:45
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| 真核细胞的mRNA在加工过程中有一个比喻为穿鞋戴帽的过程，因此mRNA的3末端都带有一段Poly A，这是利用逆转录酶制备cDNA文库的基?５?怯捎?DNA的5端的序列各不相同，如何获得全长的cDNA，如何扩增由微量的mRNA逆转录得到的cDNA文库、如何利用已知片断序列得到全长的cD |
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Southern Blots 技术
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日期：2006-08-06 23:39:45
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| Southern Blot Flow 一 基因组酶切和电泳 在200 l 微量离心管中加入： 25 l DNA样品(约10g)， 3l 限制性内切酶（MBI，10 U/ l） 5 l 相应的10buffer， 补水到50l。 然后加一滴矿物油覆盖, 稍微离心后放于37℃水浴8-12小时。酶切完后，取5l 酶切DNA样品于0.8%的琼脂糖凝 |
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