【序号】20022585

【标题】植物基因枪转化技术及其在茶树上的应用前景

【作者】吴 姗; 梁月荣

【首作者单位】浙江大学茶学系 杭州 310029

【地址】浙江杭州

【信息来源】茶叶

【年卷期页码】2002,28(3):138-144

【专业划分】经济作物

【关键词】基因枪；遗传转化；茶树;应用前景

【动态内容】植物基因工程技术是以纯化的外源DNA导入植物细胞以期获得转基因植物的方法。目前，对茶树遗传转化的研究，绝大多数都是通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)系统进行的。虽然农杆菌介导的转化方法已成为较常规、较成熟的转化手段之一，但由于茶树对农杆菌不甚敏感，且受茶树自身再生系统的限制，其转化效率不是很理想。近年来，为了在更多的植物中建立导人外源基因的试验体系，相继发展了不依赖农杆菌或不依赖植物基因型的直接基因转化法，基因枪转化系统就是其中之一。基因枪介导的转化是一种物理过程，因而不受受体基因型的限制；其受体范围广泛，又避免了冗长的原生质体的培养过程。基因枪转化已有不少成功的先例。将该技术引入茶树遗传转化的研究中，借鉴利用已有的研究成果，结合茶树特有的遗传特性，相信基因枪转化完全可以发展成为有前途的转化系统。 1  基因枪转化原理及其类型     基因枪技术的基本原理是将外源DNA包被在微小的金粒或钨粒表面，在高压作用下微粒被高速射入受体细胞或组织。微粒上的外源DNA进入细胞后，整合到植物染色体上得到表达，实现基因转化。因为颗粒的体积非常细小，再加上射击的速度非常快，所以外源基因进入细胞后仍能保持正常生物活性。并且被轰击过的细胞或组织虽含有颗粒，但仍 能存活，发育不受太大的影响。     基因枪的类型可分为火药式(Gunpowder)、气动式(Gaspowder)和放电式(Electric discharge)三种。其原理和特性已有较多的文章加以论述，在此不再赘述。     目前利用国产火药式基因枪JQ-700(中科院生物物理所)在水稻、小麦、谷子上都得到了较好的GUS表达，刘金元等人还得到了具有一定抗虫性的转基因小麦、玉米。通过气动式基因枪PDS-1000／He(Bio-Rad公司)也得到了小麦、兰花、大麦等植物转化植株。陈梁鸿等采用我国自行研制的JYQ-05-1型高压放电基因枪研究适合小麦转化的受体。用放电式基因枪ACCELLTM也已将外源基因转入大豆、棉花、花生及一些木本植物。     以大麦的胚性愈伤为材料，比较PDS-1000/He、Helions(Bio-Rad)和ACCELLTM三种不同类型的基因枪，发现：Helions基因枪系统不适合轰击大麦胚性愈伤，氦气的冲击力过强会导致受体的移位，造成各次轰击间的差异大；而使用PDS-1000／He和ACCELLTM都得到了相似的GUS瞬间表达频率；在两系统轰击力最强烈的条件下，比较对受体的伤害程度，PDS-1000／He造成的对大麦盾片的伤害大于ACCELLTM。但应用ACCELLTM系统未能象PDS-1000／He系统一样，得到稳定的转化体。原因可能是微弹制备等其他一些操作程序更适合PDS-1000／He系统，而未与ACCELLTM系统相配套。 2  影响基因枪转化频率的参数    基因枪转化频率主要受三方面因素的影响，即携带有目的DNA的微弹的性状，轰击时的物理参数和受体的生理状态。 2.1  微弹的制备     做微弹的金属微粒目前一般多用金粉或钨粉。钨粉价廉，容易制备。但钨粉与DNA结合时间过长会引起DNA降解，同时会形成对植物有害的氧化膜，因此有人在制备时进行相应的碳化处理。金粉无上述缺点，但金粉在水中趋向形成不可逆的结块，须临用前配制，且价格昂贵。     金属微粒的大小及用量也对转化有一定的影响。微粒的直径一般以0.6Bm至4Bm为宜，可根据不同的材料加以选择。Duchesne等人，的实验表明，不论是大小为70um X l0um的云杉胚柄细胞，还是大小为20um X l0um的分生组织细胞，都是以直径为1.1lum的钨粉制的弹得到最高的GUS表达频率。用直径分别为0.6um、1.0um、1.6um的金粉轰击兰花顶端分生组织诱导的原球茎状体(protocorm-likebody)，结果显示，微粒直径越小转化效率越高。金属微粒大小的选择应和其他的轰击条件相配套。在氦气压力900psi时，用直径为1.1um的钨粉轰击，在椰莱叶盘上得到的GUS表达高于直径为0.7um的钨粉；当压力为1300psi时结果则相反。安海龙等在研究金粉用量对小麦转化频率的影响时发现：每枪的金粉用量在30Bg～500ug范围内时，金粉用量越多GUS蓝斑数也越多，两者基本呈线性对应关系。而Altpeter和周淼平等都认为采用金粉用量较低的(30ug-50ug)获得的抗性植株频率或再生频率显著高于金粉用量较高的(100ug)。最适的金属微粒的大小及用量往往根据组培条件和转化系统的不同而不同，并不总表现为某一特定值。     DNA的纯度和浓度较高容易获得成功的转化。高纯度DNA射入受体细胞后整合到植物基因组的几率更高。但DNA的浓度并非越高越好，过高浓度DNA会使金属微粒凝聚成块，同时，金属微粒对DNA的吸附能力还存在一个饱和值，研究得出，每毫克直径为1.0um、1.4um、0.8um的钨粉，吸附DNA的饱和效应值分别为2.6ug、1.8ug、1.1ug。目前较多使用的浓度为lug／uL，但DNA浓度为0.3ug/uL～0.4ug/uL时，也能得到较好的结果。DNA的物理结构也对转化有影响，使用环状单链DNA的转化频率是对照超螺旋双链DNA的3倍，双链线状DNA是对照2倍，而单链线状DNA与对照差异不大。转化前使质粒DNA变性是提高转化频率较简单的方法。       为使DNA较好地附着在微弹上，制弹时需添加一定浓度的DNA沉淀剂，如CaCl2、亚精胺(spermidine)、聚乙二醇(PEG)等。Duchesne在转化云杉的愈伤时发现，CaCl2的效果较PEG好，可得到更多的GUS表达。而对Ca2+的来源，Perl(1992年)在转化小麦时，使用Ca(NO3)2优于CaCl2，但王鸿鹤等在转化香蕉时的结果却相反，看来不同的外植体对Ca2+源的要求并不相同。不同型号的基因枪对沉淀剂的选择也不相同，PDS-1000／He需要PEG的参与，ACCELLTM则不需要。一般CaCl2的最适浓度在1.9M～2.4M之间，亚精胺浓度介于7.69mM～76.9mM，聚乙二醇则选用25％PEG4000。亚精胺对植物细胞有毒害作用，因此在许多实验中都采取降低亚精胺浓度，而适当加入PEG。 微弹的制备是为了将较多的DNA更好的吸附在微粒载体上，尽量减小对细胞的伤害，从而提高转化率。但也有人除了加沉淀剂，还在DNA-金粉悬液中添加0.5mol／L～1.0mol/L的生长激素NAA，并能使GUS表达频率明显提高。他们认为这是由于生长素促进了受伤部位细胞局部分裂结果。 2.2  基因枪轰击参数   轰击参数主要包括微弹速度、射程、膛内真空度、轰击次数等。微弹速度、射程和真空度的选择及组合决定微弹的穿透力。植物组织中只有某些特定的细胞层才具有再生能力，微弹射人这些细胞中才具意义。Jarl比较了不同入射条件认为，氦气压力为51／min、射程为170mm、真空度在0.8kg／cm2，释放时间为60ms是对大麦胚较合适的轰击参数，此时GUS瞬间表达的频率高。但瞬间表达的条件在应用到稳定转化时往往被过分强调，要获得稳定的转化子还要考虑轰击条件对植株再生的影响。A1fonso-Rubi等，在1100psi压力下用3种不同的射程(6cm、9cm、12cm)轰击水稻种子的愈伤，结果6cm的射程虽然得到最多的GUS表达，但使具有再生能力愈伤的比例及每个愈伤得到的再生植株数，较其它处理下降1.5倍～2倍左右。轰击次数也同样影响到转化效率和再生频率两个方面，轰击次数的增多，一方面使瞬间表达频率提高，但也造成对细胞伤害的增大，因此，一般不超过3次，弹膛内真空度是减少阻力，提高微弹速度的技术措施。不同的材料对真空的耐受度不同，大多控制在0.05Mpa-0.095MPa之间。另外，也有人对间隙距离(gapdis-tance)，即裂圆片(rupture disc)到宏载体(macro-carrier)间的距离和宏载体的飞行距离进行研究。但不是所有的基因枪都能对这两项参数进行调整。 2.3  生理状况   在基因转化中起主导作用是植物本身，因此受体细胞生理状态对转化有重要的影响。这些因素包括外植体种类、细胞生理状态、细胞潜在再生能力、轰击前后的培养条件及细胞是否处于感受态等。   Clarke等认为开花后7d～10d的小麦胚乳最适于做轰击材料；也有研究认为，小麦幼穗诱导培养16d，幼胚诱导培养15d后再进行转化能获得最高的GUS表达频率。刁现民等在研究谷子转化时发现：以谷子的松散型愈伤为受体，虽然GUS表达频率最高，但植株再生困难；而质密型愈伤的转化频率又太低；只有松软型愈伤的转化频率高且再生好，可作为谷子转化的良好受体。Zhang等改变以往常用愈伤、叶盘、原生质体为材料的情况，以大麦和燕麦发芽的种子诱导的顶端分生组织为转化受体，这样不仅避免了脱分化和再分化的过程，且克服了体克隆的变异和大麦再分化过程中常出现的白化病现象。研究水稻发现，KDML105S和P60两水稻品种的幼胚比成熟种子诱导的愈伤更适合作为基因枪的转化受体。 转化体进行预培养，使之处于感受态而提高转化率。转化香蕉薄片，经过预培养外植体的转化率(17.5％～42.11％)普遍高于对照(12.20％)。转化小麦时，在幼胚预培养培养基中以2mg／L dicamba替代2mg／L 2，4-D，或添加0.5mg／L ABA都可提高愈伤的再生能力。 在轰击前后对外植体作一定的渗透处理也有助于提高转化频率。Nandadeva等，比较了蔗糖、麦芽糖、甘露醇、山梨醇4种不同渗透剂对水稻胚性细胞转化的影响：在0.2M、0.3M、0.4M、0.5M、0.6M五个浓度下作预处理，都是甘露醇的处理得到最高的GUS表达频率，蔗糖效果最差，且4种渗透剂都随使用浓度的增大使转化频率增高；但稳定转化子的结果则相反，用蔗糖处理得到最高的转化频率，而浓度对转化结果的影响也不明显。渗透剂的使用对外植体的再生频率也有影响，轰击前后的渗透处理使水稻胚性愈伤的再生频率降低，但从每个愈伤所诱导的再生植株数增加。渗透处理使细胞发生质壁分离，从而减少了轰击时由细胞质溢出造成的细胞损伤。但也有报道认为，渗透处理椰菜的子叶反而对转化有负作用，特别是渗透浓度较高(0.5M甘露醇和0.5M山梨醇)，预处理时间较长(7h)的情况下。渗透是一种协迫，因此对外植体会造成一定的伤害，不同的植物及不同的外植体类型对渗透的敏感性不同，因此造成以上不同的结果。但值得注意的是，王鸿鹤等提出在高渗处理后必须吸干外植体表面的水分，留有水层对转化有较大影响。 3  茶树转化系统现状及基因枪的应用前景 3.1  农杆蕾转化系统     茶树的转化多采用农杆菌体系，研究也多集中在对此体系的优化上。如侵染前外植体预培养、侵染时农杆菌菌液浓度、侵染时间、及其培养的时间、温度、光照条件和真空度等。此外，为了提高转化率，也研究了一些添加物，如乙酰丁香酮、硝酸银等对转化的影响。  虽然利用不同的农杆菌得到了一些GUS瞬间表达或检测到GFP报告基因的存在，但在茶树的遗传转化的研究中，茶树还是被认为是一种较难被农杆菌侵染的植物，被转化的频率较低。另一方面，对茶树再生系统的研究还不够深入透彻，使转化体成苗较难。Mvichiyo等虽然成功的把蛋白溶解酶导人茶树外植体，并且通过PCR及RT-PCR验证了转化的愈伤中该基因的存在，但仍没有转化植株的报道。 3.2  基因枪的应用及前景     在90年代中期，奚彪将基因枪作为介导转化的工具引入到茶树遗传转化研究上。轰击茶树体胚并得到GUS表达。比较不同发射压力、入射次数对体胚再生频率的影响，认为：单枪入射时，1100psi和1300psi相差不大，再生频率在20％～30％之间；轰击两次时，1300psi会造成过多的伤口，不易再生新的体胚。渗透处理后，发现高渗使组织表面变厚，也使细胞处于不活跃生长状态，反而使GUS瞬间表达频率下降。用ABA处理，表皮虽不增厚，但细胞仍不活跃无助于瞬间表达。因此他认为选择恰当的导入时机是重要的。     目前，我们实验室也正通过GJ-1000型气体基因枪对茶树的遗传转化进行研究。我们依据影响基因枪转化频率的三方面因素，对外植体轰击前预培养的条件，轰击时的最佳参数，及制弹的过程等进行了优化。并将进一步结合农杆菌系统对茶树的转化体系进行研究。     基因枪技术由于具有不受基因型限制及其转化受体广泛的特点，还被广泛应用到其他与植物遗传转化相关的研究领域。如对报告基因、启动子的研究；对某些基因表达调控的研究；甚至在细胞间物质传递、植物根际微生物利用等研究中，也扮演了重要的角色。     在茶树基因工程的工作中，也不妨进一步挖掘基因枪潜力开展更深层次的研究。将一些已经较成熟的抗虫基因、Bt基因、蛋白酶抑制基因等同时导入茶树，实现多价转化。同时也能使一些已克隆或将克隆得到的茶树基因，如多酚酶基因、咖啡碱合成酶基因、控制茶树休眠的基因等得到充分的利用。使茶树产量提高，品质也朝着人们期望的方向发展。另外，研究茶树细胞器特定的启动子，利用基因枪将外源基因导人细胞器中，从而可以克服外源基因随花粉扩散等核转化技术的不足。         基因枪转化虽然还有不少需要解决的问题，如仪器的可控性、准确性、精确性，和轰击后进人受体细胞DNA的生物学变化及其调控理论等。但基因枪转化法仍为茶树遗传转化工作开拓了新的前景。