实验题目：层析技术
教    师：XXX
实验类型：基本技术
学　　时：8(参考)
内　　容：

一、仪器设备 紫外检测仪、蠕动泵、记录仪、ATK层析系统、层析柜、树脂、样品等。

二、仪器结构 
 

三、原　　理

    由于填料的不同，各个实验室所使用的层析技术的原理也不完全相同。但不外乎以下几种基本原理：分子筛作用、离子交换作用、亲和层析作用等等。分子筛作用是由于填料上有一定规格的孔径，分子量大小不一样的样品流过柱子时所受到的作用力不一样，所走的路径也不同，所以流出柱子的时间也就有了差异，不同组分得以分开。离子交换是由于正负电荷的吸引而使样品挂在填料上，改变溶液环境，使样品分子所带的电荷产生变化，从而被洗脱下来，不同组分与柱料的吸附作用力时不同的，从而洗脱条件也是不同的。亲和层析就是柱料与被分离样品特异性的吸附结合一起，从而使被分离物质与其他成份分离开来。

 

四、适用范围

1．蛋白质分子量的测定。

2．蛋白质的分离纯化

3．多糖的分子量测定

4．多糖的分离纯化

 

五、操作步骤

1．柱料的前处理

2．选择合适直径与长度的层析柱，装柱

3．装完柱之后就连上紫外检测器，检验260nm处的吸光值。

4．用上样缓冲液平衡柱子。

5．将样品液浓缩后上样，

6．洗脱液洗脱，部分收集器收集各个组分。

7．分别测定各个组分的浓度和含量。合并活力峰。

 

七、注意事项

1．柱料前处理一定要彻底，完全，将杂质全部除去。

2．上样之前柱子平衡要过夜。

3．分子筛层析时点样量不能过大，柱面一定要平。

4．上样、洗脱时一定要对目标产物跟踪去向。

 

七、思考题

1．分子筛层析、离子交换层析样品在流经柱子的时候都受到哪些力的作用？

2．分子筛层析、离子交换层析对柱料前处理、上样和洗脱的要求有何不同？

3．如果两种组分分离不开，试解释其可能的原因？

4．上样之前如果不进行平衡，会对结果产生什么影响？