实验题目：PCR技术
教    师：XXX

实验类型：基本技术
学　　时：2(参考)
内　　容：

1、PCR技术的基本原理：

　 PCR的最大特点是其扩增产物的特异性、扩增效率的灵敏性、扩增程序的简便性。引物序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。通过人工合成的特异性引物和Taq DNA 聚合酶，从模板DNA中扩增出所需的DNA片段。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：
　　①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；
　　②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
　　③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。(Plateau)。到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

2、PCR的反应动力学：

PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA 片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应” ，这种效应称平台期数、PCR 扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。

3、 PCR扩增产物

可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5'端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3'端开始延伸，其5'端是固定的，3' 端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结时，由于新链模板的5'端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3'端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加， 几乎可以忽略不计， 这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析。

 

1、从基因组中调取特定基因

2、mRNA逆转录制备cDNA

3、基因定点突变

4、DNA片段加入粘性末端

5、核酸中引入特定酶切位点

6、核酸测序

7、cDNA3’或5’末端的快速扩增

 

主要通过选择键“< >”来确定执行的功能,用“PROCEED”输入所设定的各种参数，用“CANCEL”，取消输入或退回到前一步程序。以后各操作均如此，不再重复叙述。

    -Program Program 

按PROEEED键，则显示如下：

通过选择键“< >”，RUN下方显示的程序名称不断变化，可选择运行仪器内已存在的程序名称，此时再按“PROCEED”显示如下：

Enable      Disable

Heat bannet

（2）编写新程序

    本仪器在出厂前已含有14个程序，具体名称和程序见原厂说明书，在具体使用时，操作人员可按需要编写程序，输入后会自动贮存，关机后可长期保留，本仪器贮存80个程序，每个程序最多可编100步9999个循环。

此时可选择编程每步所要进行的操作，用“<>”选择，然后按“PROCEED”输入。

①设定温度和时间（TEMP）

可设定温度范围从-4度至105度，时间从1秒至99小时59分59秒之间或无限长。输入温度时可显示：

Step1        Hrs

Min          Sec

这时输入设定温度的持续时间。若某项时间为“0”，可直接按“PROCEED”输入时间后，按“PROCEED”键，则显示：

Step2           一TEMP

这时可以进行第2步的编程，选择相应的操作。

②设定循环程序(GOTO)

这时可以设定程序从哪一步循环，例如转到第2步开始循环，则在GO TO STEP后输入“2”，显示为：

这时可以输入循环的次数，如需从第1步到第3步循环30次，则输入29，循环结束后进入下一步。

EXTEND，是用于时间延伸，负值为时间的缩短，例如：

开始希望在65度，输入65后则出现：

    Min_    Sec

这时可输入初始的保留时间，例如40秒，则按“PROCEED”后，显示变为：

这时可输入每次循环的时何变化率，如“2”，即保留时间从初始的40秒开始经每次循环增加2秒。

INCREMENT：与上述原理相同，只不过是温度的变化。

SLOPE：为循环时间和温度同时变化。

这时按“PROCEED'’输入最后一步“END”。再按一次“PROCEED”。确认该程序已编写结束，这时已自动贮存在仪器内，程序运行到最后一步即END时，仪器停止加热或降温，并显示“COMPLETE"。基座将回到室温状态。

这时可选择所要列出的程序内容的程序名称，如选“Quickstep”，按PROCEED后，会显示程序的内容，格式如下：

由上图可知QUICKSTEP这个程序的第一步是设定温度在94度保留5秒，用“<>”可变换显示每一步程序内容。显示最后一步“END'’，再按一次“>”则回到初始显示状态。LIST只是列出程序内容以供观察参考，不能改变程序各项值。

用“< >”移动光标到所要修改的内下，输入新参数，按“<>”转换程序内容以便作另外的修改，继续按“>”直到退回初始状态，修改即告完成。

用“< >”选中程序后按PROCEED，则该程序已从仪器贮存器中删除。

 

1、电源

1.1、本机对电源无特殊要求，运用范围宽，交流1000V-240V，但电源电压不能波动太大，以免损坏机内器件，否则应考虑加装稳压电源。

1.2、本机在运行程序过程中，禁止用切断电源的方式结束实验，原因有二：其一，对执行程序不利；其二，电源切断后，风机停转，元件散热不畅，易积热损坏。

2、样品温度探头

样品温度探头在使用的过程中，应加有少许矿物油等，不易挥发液体。加油要适量，浸没电极头即可，禁止加水及其他易挥发液体；禁止不加油使用，以免电极头受热不均，积热损坏。平时应注意探头有无破裂，及探头内油是否外漏。

3、LED显示屏

本机应避免使用紫外线消毒，以防止破坏LCD液晶显示屏，使用过程中，应避免硬性物体磕碰、划伤、以免损坏。

4、清洗注意事项

当您清洗本机基座时，应避免液体进入机器内部，您在做实验过程中，也许加有放射性物质，在清洗时应格外小心。本机不宜在潮湿、暴晒的环境中使用。

 

1、PCR的原理是什么？

2、PCR扩增有哪些实验步骤？

3、PCR仪使用过程中有哪些注意事项？