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实验题目：革兰氏染色及芽孢染色
教 师：XXX
实验类型：基础
学 时：4 (参考)
内 容：
一、实验目的
1.了解革兰氏染色法和芽孢染色法的原理，并掌握其操作方法。
2.了解革兰氏染色法在细菌分类鉴定中的重要性。
3.学习并掌握微生物涂片、染色的基本技术和无菌操作技术。
4.学习显微镜(油镜)的使用方法。
5.初步认识细菌的形态特征。
二、实验原理
革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂结晶紫进行染色，再用碘液媒染，然后用乙醇(或丙酮)脱色，最后用复染剂(如番红)复染。经此方法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色(红色)，该菌属于革兰氏阴性菌。革兰氏染色反应是细菌重要的鉴别特征，为保证染色结果的正确性，采用规范的染色方法是十分必要的。
芽孢染色法的基本原理，用着色力强的染色剂孔雀绿或石炭酸复红，在加热条件下染色，使染料不仅进入菌体也可进入芽孢内，进入菌体的染料经水洗后被脱色，而芽孢一经着色难以被水洗脱，当用对比度大的复染剂染色后，芽孢仍保留初染剂的颜色，而菌体和芽孢囊被染成复染剂的颜色，使芽孢和菌体更易于区分。
三、试剂与器材
1.材料：枯草芽孢杆菌12～18h营养琼脂斜面培养物，大肠杆菌约24h营养琼脂斜面培养物
2.试剂革兰氏染色液(结晶紫液、碘液、95％乙醇、番红液)。5％孔雀绿水溶液
3.实验器材小试管、滴管、烧杯、试管架、滤纸、木夹子、载玻片、盖玻片、凹载玻片、无菌水、显微镜等、接种环、双层瓶(内装香柏油和二甲苯)、擦镜纸、生理盐水等。
四、实验内容
1.革兰氏染色法
制片→初染→媒染→脱色→复染→镜检。
2.Schaefer-Fulton氏染色法
制片→染色→水洗→复染→水洗→镜检。
五、关键步骤及注意事项
1.涂片时，生理盐水及取菌不宜过多，涂片应尽可能均匀，
2.乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节，严格掌握脱色时间。
六、思考题
1.你认为要得到正确的改良的革兰氏染色结果必须注意哪些操作?关键在哪一步?为什么?
2.现有一株细菌宽度明显大于大肠杆菌的粗壮杆菌，请你鉴定其革兰氏染色反应。你怎样运用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为对照菌株进行涂片染色，以证明你的染色结果正确性。
3.你的染色结果是否正确?如果不正确，请说明原因。
4.若涂片中观察到的只是大量游离芽孢，很少看到芽孢囊及营养细胞，你认为这是什么原因?
5.说明芽孢染色法的原理。用简单染色法能否观察到细菌的芽孢?
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