实验题目：蔗糖酶的N-末端氨基酸测定
教  师：XXX

实验类型：基础
学　　时：8(参考)

内　　容：

一、实验目的 
掌握FDNB法测定蛋白质N-末端氨基酸的原理和方法。

二、实验原理 
FDNB与蛋白质在室温，pH=8.0—9.0条件下反应，生成DNP—蛋白；随之，在105℃，6mol/LHCl条件下水解，生成DNP—氨基酸及其它游离氨基酸。由于DNP—氨基酸溶于乙醚，而其余氨基酸不溶，故用乙醚抽提出DNP—氨基酸，再将未知样的DNP—氨基酸与已知标准DNP—氨基酸共同进行纸层析，根据Rf值即可推断未知样N末端为何种氨基酸。

三、试剂与器材  
•锥形瓶•25—50ml分液漏斗•层析缸•离心机•黑纸•水解管•层析纸•毛细管 •离心管•培养皿(1)10%碳酸氢钠溶液（2）1mol/L氢氧化钠溶液（3）5%FDNB乙醇溶液 （4）浓盐酸（优级纯）（5）乙醚的处理： （6）乙醇（7）1.6mol/L， pH=6.0的磷酸盐缓冲液。（8）6 mol/L 盐酸

四、操作方法 
DNP—蛋白的制备、DNP—蛋白水解、DNP—氨基酸的抽提、DNP—氨基酸的鉴定、计算迁移率Rf值

1、由于反应期间有二氧化碳和氟化氢气体生成，因此，在振摇期间应间隔放气，以免反应液随气体冲出，腐蚀皮肤，且放气时管口不要对着别人。

2、反应过程中应注意溶液pH值的变化，使其保持在pH8.0-9.0，若低于此范围，应用1mol/L氢氧化钠溶液调整，注意pH值不可过高，若pH超过9，则易使FDNB分解成二硝基苯酚（DNP—OH）。

3、由于加入盐酸后，会有大量的二氧化碳气体产生，因此在加完每一滴盐酸，待反应产生的气体消除后，再加入第二滴，防止气泡冲出管外。

4、以下步骤，均取血红蛋白单独操作。※ 每次洗涤液不必太多，以免离心时冲出，只需将沉淀浸没即可。

5、最后一次醚洗涤后，弃去上清，不断搅拌沉淀直至黄色干粉状（此时可打开管上的胶布和黑纸）。此步一定要不断搅拌，使乙醚很快蒸发，否则DNP—蛋白会结成硬块，不易水解完全。

6、水解管封管时，应先将管内的冷空气赶尽，否则在烘箱内加热时会膨胀引起管炸裂。

7、水解时间的长短与蛋白质及其N—末端氨基酸的种类不同而异。

8、水的用量不宜过多，以免DNP—丝氨酸或DNP—苏氨酸部分溶于水层，造成损失，醚层中含有醚溶性DNP—氨基酸。

9、DNP—组基酸和DNP—精基酸是水溶性的，不能被乙醚抽提，而留在水相。若怀疑蛋白或肽的N—末端氨基酸是组氨酸或精氨酸时，则应将水层在60℃水浴上蒸干，再加入1ml蒸馏水，蒸干，反复两次以除去盐酸，再进行鉴定。

10、点样时不能太靠纸的边缘，以免溶剂效应，使点扩散，样品相隔也不要太近，以免互相重叠，丙酮加入量不要太多，以免浓度太低，走出的斑点颜色淡，但浓度过大，则易形成拖尾。

1、分析和鉴定 DNP—氨基酸采用什么方法？为什么采用此方法？