实验题目：啤酒酵母蔗糖酶的提取、分离纯化及米氏常数的测定
教    师：XXX

实验类型：综合
学　　时：37(参考)

内　　容：

一、实验目的
（1）了解酶分离提纯的一般原理和步骤

（2）掌握有机溶剂分级和透析技术

（3）掌握柱层析的原理和方法

（4）学会3，5—二硝基水杨酸比色定糖法的原理和操作方法

（5）了解底物浓度和酶反应速度之间的关系

（6）掌握测定米氏常数的原理和方法

二、实验原理 
1、细胞破壁：就酶在生物体内的分布，可分为胞内酶和胞外酶，蔗糖酶系胞内酶。提取胞内酶时，要破碎组织和细胞，然后用一定的溶液提取，得到的材料称为无细胞抽提液。材料不同，破壁的方法也不同。我们用的菌体（微生物）细胞破壁方法是：自溶法，即将菌体放在适当的pH值和温度下，利用组织细胞自身的酶系将细胞壁破坏，使细胞内的物质释放出来。自溶时需加少量防腐剂，以防外界细菌污染。自溶法的缺点是时间较长。

2、3，5-二硝基水杨酸比色定糖的原理

 （1）DNS试剂+ D-葡萄糖           氨基化合物

                        （还原糖）            （棕红色）

（2）在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度成一定比例关系（可用于比色测定），所以可用DNS比色法测定还原糖的含量。

（3）该方法是半微量定糖法，操作简便、快速、杂质干扰较少。

三、试剂与器材 
恒温水浴、自动部分收集器、恒温箱、梯度洗脱装置、冰箱、层析柱、分析天平、电磁搅拌器、秒表、离心机、可见分光光度计、冻干机、沸水浴等。3,5二硝基水杨酸试剂(DNS)、5%的蔗糖溶液、1mol/L的 NaOH溶液、乙酸钠、0.2mol/L,pH4.6的醋酸缓冲液 6. 乙酸乙酯

四、操作方法
① 细胞破壁→抽提→两次乙醇分级→透析→装柱→洗涤→洗脱→收集酶活力峰→制冻干粉

② 制作3，5—二硝基水杨酸比色定糖法的标准曲线并测定三种酶样品的活力

③ 测定三种酶样品的蛋白浓度

④ 计算各步酶样的比活力、提纯倍数和收率

⑤ 用双倒数作图法测定蔗糖酶的K_m值

① 乙醇分级时，注意低温、防止乙醇局部过浓，离心后要迅速溶解酶样
② 装柱均匀，无截面、无气泡，床面平整，柱体垂直

③ 分离提纯的全过程中，防止酶失活并用测定酶活力的方法跟踪酶的去向
④ 在测定米氏常数时，将酶样溶解后一定要稀释到合适的浓度。
⑤ 酶活力测定及作图一定要准确。

六、思考题
1、简述蔗糖酶分离提取的原理及操作步骤。

2、3，5-二硝基水杨酸比色定糖法的原理及操作注意事项。

3、用723分光光度计制作工作曲线的要求。

4、蔗糖酶活力测定的原理及两个反应。